专利名称：猫眼草提取物及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及从药用植物猫眼草(Euphorbia Lluaulata Bge)中分离提取抗炎活性物质及其制备方法和用途。
背景技术：
困扰人们的日常炎性疾病包括，关节炎症例如骨关节炎、类风湿性关节炎、类风湿性脊椎炎、痛风关节炎等；炎性皮肤病例如湿疹、牛皮癣、皮炎等；炎性眼疾例如眼色素层炎、结膜炎等；肺部疾病例如哮喘、支气管炎、急性呼吸窘迫综合症等；菌血症、那毒素血症、口疮溃疡、龈炎、胰腺炎等；胃肠道疾病例如节段性回肠炎、萎缩性胃炎、溃疡性结肠炎、腹腔炎、消化性溃疡、应激性肠道综合症例如由幽门螺旋杆菌感染而引起的粘膜炎症或者由非甾体类抗炎药引起的肠胃病等等。
有关各种炎症致病作用的机理，已知体内一氧化氮(NO)是介导细胞免疫和炎症的毒性物质。其前体是左旋精氨酸(L-arg)，L-arg在NO合成酶(NOS)的作用下生成NO。目前已经分离出三种不同类型的NOS，包括内皮NO合成酶(eNOS)，神经元NO合成酶(nNOS)及诱导型NO合成酶(iNOS)。目前已知，巨噬细胞、肝细胞、平滑肌细胞、腺癌细胞以及上皮细胞均能表达iNOS。某些炎性细胞因子和微生物产物如脂多糖(LPS)则可诱导iNOS表达。iNOS一旦被诱导即可表达出高度活性，产生大量NO。
因此，长时间以来，人们致力于寻找诱导型NO合成酶iNOS的抑制剂来治疗与之相关的炎性疾病。但这些抑制剂大多局限于化学合成的物质，副作用较大。现有技术中尚未发现从天然中草药植物中提取抗炎活性物质的报道。
猫眼草(Euphorbia Lluaulata Bge)在中国作为镇咳、去痰药使用，用于慢性支气管炎。收载于《中华人民共和国药典》1977年版一部中，中国名为猫眼草，日本名为ビョウガンソウ(猫眼草)。分布在中国河北、内蒙古、山西等地区的干燥地带，为多年生草本植物。
本植物味苦，性微寒，有毒；具有祛痰、镇咳、平喘、散结消肿，拔毒，止痒、抗菌的药理作用。用于慢性支气管炎的治疗时临床效果好，主要用于慢性支气管炎的咳嗽痰多；外治淋巴结结核，癣疱发痒等。例如，中国专利CN1326751A(
公开日2001年12月19日)就披露了一种猫眼草水煮液经加工制成用于医疗淋巴结核和鼠疫的猫眼膏。
但迄今为止，对于猫眼草的活性成分的研究很少深入。在猫眼草中已经探明分布和结构的化合物举例如下该植物茎、叶中含有黄酮苷、甾类、挥发油、酚类化合物；从地上部分分离得到茨烷醇、栎精等苷类化合物；种子及全草中含有香豆素类化合物。但是各类化合物的作用大多尚待进一步明确。
因此本发明人从猫眼草中提取具有明确抗炎活性的组分，其安全无毒，并能有效地抑制iNOS酶活，从而抑制NO的大量生成，达到抗炎作用。
发明内容
本发明提供了一种猫眼草提取物名称为栎精-3-O-(2″，3″-二棓酰基)-β-D-吡喃半乳糖苷的化合物，其具有如下的结构式
本发明涉及一种从药用植物猫眼草(Euphorbia LluaulataBge)中提取活性物质的方法，其特征在于包括如下的步骤 1)用丙酮对猫眼草进行提取并浓缩； 2)对上述步骤1得到提取物悬浮在水中，依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇作为洗脱液分别萃取，得到萃取物； 3)对步骤2所述有机溶剂萃取物进行NO生成抑制活性测试和毒性试验，并对NO生成抑制活性高且无毒性作用的萃取物进一步柱层析分离，得到洗脱液； 4)对步骤3中分离得到的洗脱液进行NO生成抑制活性测试，并对NO生成抑制活性高的洗脱液进一步分离精制，得到活性物质； 5)对步骤4中分离得到的单一成分化合物进行NO生成抑制活性测试以及理化特性分析以确定其结构。
其中，步骤1优选丙酮提取浓度为70％。
其中，步骤3优选用Sephadex LH-20层析柱进行分离，依次用50％甲醇、70％甲醇、甲醇、丙酮洗脱。
其中，步骤4优选为用CHP-20层析柱和/或HPLC进行精制，精制方法为利用CHP-20层析柱分离，依次用30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、甲醇洗脱；利用HPLC(柱YMC Guard park ODS-AL150×10mm I.D.)上精制，流动相0.1％TFA-甲醇-乙腈(60∶30∶5)紫外检测波长254nm。
其中，NO生成抑制活性测试是利用小鼠巨噬细胞系RAW264.7进行分析的，供试品浓度为100μg/ml。
其中的毒性作用是通过MMT细胞毒性试验进行分析的。
其中的理化特性分析技术包括核磁共振技术。
优选其中的活性化合物具有抗炎活性。
其中的活性化合物包括栎精-3-O-(2″，3″-二棓酰基)-β-D-吡喃半乳糖苷、栎精-3-O-(2″-棓酰基)-β-D-吡喃半乳糖苷、1，3，4，6-四-O-棓酰-B-D葡萄糖苷、海棠苷、栎精、3，4-二羟基苯甲酸、藤黄菌素、芹菜素等。
栎精-3-O-(2″，3″-二棓酰基)-β-D-吡喃半乳糖苷、栎精-3-O-(2″-棓酰基)-β-D-吡喃半乳糖苷、1，3，4，6-四-O-棓酰-B-D葡萄糖苷具有抑制NO生成的活性。
本发明还涉及栎精-3-O-(2″，3″-二棓酰基)-β-D-吡喃半乳糖苷、栎精-3-O-(2″-棓酰基)-β-D-吡喃半乳糖苷、1，3，4，6-四-O-棓酰-B-D葡萄糖苷、海棠苷、栎精、3，4-二羟基苯甲酸、藤黄菌素、芹菜素在制备治疗与NO合成酶相关的炎症的药物中的用途。
本发明所取得的有益技术效果是首次从猫眼草中分离得到具有明确抗炎活性的物质，其作为天然的诱导性NO合成酶iNos的抑制剂，克服了化学合成物质的毒副作用。
具体实施例方式 实施例1.猫眼草提取物的制备方法 (1)猫眼草的粗提方法和产物 取猫眼草(Euphorbia lunulata Bge)9.0kg，用70％丙酮(27L)提取三次，浓缩提取液，所得浸膏加水使之成为悬浊液，依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取。对这三种萃取物分别进行NO生成抑制实验和MTT实验，样品浓度为100μg/ml。结果示于表1 表1.各萃取物的收率、NO生成抑制率及MTT毒性 选择其中NO生成抑制率高而又无MTT毒性的乙酸乙酯萃取物继续下一步的操作。
(2)乙酸乙酯萃取物层析分离方法和产物 将乙酸乙酯萃取物46.1g上Sephadex LH-20层析柱进行分离，依次用50％甲醇、70％甲醇、甲醇、丙酮洗脱，收集洗脱液共计9个馏分，并对其逐个进行NO生成抑制实验，结果示于表2(Fr.意为组分) 表2.各馏分收率和NO生成抑制率 选择其中NO生成抑制率高且收率较好的馏分4和8继续下一步的操作，鉴于组分5收率最高，且NO生成抑制率也不是太低，也进入下一轮操作。
(3)馏分4、5和8的分离精制方法和产物 因此利用CHP-20层析柱对Fr.4、Fr.6、Fr.8分别进行分离，依次用30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、甲醇洗脱。
其中，自Fr.4中分离纯化得到6个组分Fr.4-A(867.2mg)、Fr.4-B(58.1mg)、Fr.4-C(57.7mg)、Fr.4-D(81.5mg)、Fr.4-E(0.52g)、Fr.4-F(16.6mg)。其中的Fr.4-D在反相TLC(0.1％TFA∶甲醇＝60∶40)显示一个单独的点，在反相高效液相层析HPLC(柱YMC Guard park ODS-AL 150×10mm I.D.)上精制，流动相0.1％TFA-甲醇-乙腈(60∶30∶5)紫外检测波长254nm，得化合物(1)〔5.3mg〕。
其中，自Fr.5中分离纯化得到5个组分Fr.5-A(2.02g)、Fr.5-B(0.16g)、Fr.5-C(33.2mg)、Fr.5-D(0.07g)、Fr.5-E(56.4mg)。在Fr.5-A中有结晶析出，用甲醇重结晶，得化合物(2)〔0.25g〕。
其中，自Fr.8中分离纯化得到9个组分Fr.8-1(10.7mg)、Fr.8-2(17.0mg)、Fr.8-3(356.5mg)、Fr.8-4(352mg)、Fr.8-5(34.5mg)、Fr.8-6(13.1mg)、Fr.8-7(19.4mg)、Fr.8-8(354mg)、Fr.8-9(98.1mg)。Fr.8-4经HPLC(柱YMC Guardpark ODS-AL)上精制，流动相0.1％TFA-甲醇-乙腈(60∶30∶5)紫外检测波长254nm，得化合物(3)〔3.3mg〕。
实施例2.主要化合物的理化性状 对分离纯化得到的3个化合物的理化参数进行分析，主要数据显示于表3、4和5中。
表3.化合物1-3的基本理化性状 表4.化合物1和2的1H和13C-核磁共振数据(500MHz，溶于DMSO-d6) 表5.化合物3的1H和13C-核磁共振数据(300MHz，溶于丙酮) 化合物1-3的结构如下
实施例3.猫眼草提取物的NO生成抑制活性 所用材料 RAW264.7细胞(巨噬细胞，经Abelson白血病毒转化)，由美国ATCC(美国典型培养物保藏中心)获得。用含10％FBS的Ham’s F12培养液在5％CO2，37℃条件下培养。
IFN-γGenzyme/Techne公司；LPSSigma公司；磺胺Wako公司；N-1-盐酸萘乙二胺(N-1-Naphthyethylene-diamine Dihyrochloride)Wako公司Griess试剂(1)将N-1-盐酸萘乙二胺溶于5ml注射用水中； (2)向5ml注射用水50mg磺胺中加入250μl磷酸。
仪器微滴定板读数器(3550型微滴定板读数器，BIO-RAD)。
具体方法与结果 取RAW264.7细胞50ml放于Falcon管中离心(1000rpm，3min，4℃)，沉淀细胞，用吸管除去上清，加入新培养基10ml、使之悬浊。(调整浓度至1.5×105个/ml)注入96孔板，每孔200μl，在CO2孵箱中放置1-2小时。加入LPS(10μg/ml Sigma055B5)2μL、小鼠INF-γ(33ng/ml Genzyme)2μL、待测化合物0.4μL。放入CO2孵箱中培养16小时。终浓度为INF-γ0.33ng/ml、LPS 100ng/ml。待测化合物溶于DMSO、相对培养基的含量为0.2％。显微镜下观察。进行MTT实验。利用griess法进行NO生成评价，取上清100μL加入0.1％N-1-盐酸萘乙二胺溶液50μL、对胺基苯磺酸酰胺50μL、室温避光放置10′。利用分光光度计测570nm(对照655nm)的O.D.值。活性评价 计算出NO2-的量，代入下面的公式求出抑制效果 抑制效果(％)＝{1-(X-Y)/(Z-Y)}×100 X在实验化合物存在下，由IFN-γ和LPS诱导产生的NO2的量， Y在实验化合物、IFN-γ和LPS均不存在的情况下，诱导产生的NO2的量， ZIFN-γ和LPS诱导产生的NO2的量。
NO生成抑制效果的IC50如下表6所示 表6.化合物1-3的NO生成抑制活性结果 可见，化合物1、2和3都具有很强的NO生成抑制活性。
实施例4.猫眼草提取物对iNOS、TNF-a、COX-2、IL-12的mRNA表达抑制实验 RAW264.7细胞(1.2×106细胞/mL)与化合物IFN-γ(10U/mL)和LPS(100ng/mL)一起培养6小时。用RNA分离试剂盒(QIAGEN公司制造)抽提总RNA。测定260nm下的吸光值确定RNA的量、用250ngRNA和寡(dT)12-18引物反转录制备cDNA。以所得的cDNA为模板进行PCR反应。所述的反应在50mM KCl、5mM MgCl2、0.2mM dNTP、0.6单位的Ampli Taq酶(Ampli Taq gold)(Applied Biosstems)、0.4μMmol正义及反义引物在30μl的反应溶液中进行。针对INOS所用引物为5’-ACCTACTTCCTGGACATTACGACCC-3’[S]、5’-AAGGGAGCAATGCCCGTACCAGGCC-3’[AS]；β-肌几动蛋白的引物为5’-TGGATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3’[S]、5’-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3’[AS]；TNF-a的引物为5’-AGGCGCCACCACGCTCTTCT-3’[S]、5’-GGCAGCCTTGGCCCTTGAA-3’[AS]。COX-2的引物为5’-TCAAAAGAAGTGCTGGAAAAGGTT-3’[A]、5’-TCTACCTGAGTGTCTTTGACTGTG-3’[AS]。IL-12的引物为5’-AAGGAAAATGGAATTTGGTCCACTG-3’[S]、5’-GATGATGTCCCTGATGAAGAAGCTG-3’[AS]。PCR反应是按如下方式进行的94℃1分钟(变性)、60℃1分钟(退火)、72℃1.5分钟为一个循环共进行25个循环。PCR产物在2％琼脂糖中电泳后，经溴化乙锭染色测定。
猫眼草提取物对iNOS的mRNA表达具有浓度依赖性的抑制作用。并且，由对TNF-a、IL-12和COX-2的mRNA的表达抑制可以推定其可抑制转录因子NF-κB的活化(下图)。
上图为猫眼草提取物对iNOS、TNF-a、COX-2和IL-12的mRNA的表达抑制结果。
结果显示猫眼草提取物对iNOS的mRNA表达具有浓度依赖性的抑制作用。对TNF-2、IL-12及COX-2的mRNA的表达也有抑制作用，推测对转录因子NF-κB的活化抑制。以上这些炎症因子与急慢性炎症、过敏性疾病等疾病机理密切相关，在猫眼草提取物中分离到的这些炎症因子抑制剂可以用于制备治疗急慢性炎症、过敏性疾病等相关疾病的药物。
权利要求
1.一种猫眼草提取物，其特征在于包括名称为栎精-3-O-(2″，3″-二棓酰基)-β-D-吡喃半乳糖苷具有如下的结构式
2.如权利要求1所述的猫眼草提取物，其特征在于它具有抑制NO生成的活性。
3.猫眼草提取物1，3，4，6-四-O-棓酰-B-D葡萄糖苷，其特征在于它具有抑制NO生成的活性。
4.猫眼草提取物栎精-3-O-(2″-棓酰基)-β-D-吡喃半乳糖苷，其特征在于它具有抑制NO生成的活性。
5.猫眼草提取物栎精-3-O-(2″，3″-二棓酰基)-β-D-吡喃半乳糖苷、栎精-3-O-(2″-棓酰基)-β-D-吡喃半乳糖苷、1，3，4，6-四-O-棓酰-B-D葡萄糖苷、海棠苷、栎精、3，4-二羟基苯甲酸、藤黄菌素、芹菜素，其特征在于在制备治疗与NO合成酶相关的炎症的药物中的用途。
6.一种从药用植物猫眼草中提取活性物质的方法，其特征在于包括如下的步骤
1)用丙酮对猫眼草进行提取并浓缩；
2)对上述步骤1得到提取物悬浮在水中，依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇作为洗脱液分别萃取得到萃取物；
3)对步骤2)所述萃取物进行NO生成抑制活性测试和毒性试验，并对NO生成抑制活性高且无毒性作用的萃取物进一步柱层析分离，得到洗脱液；
4)对步骤3)中分离得到的洗脱液进行NO生成抑制活性测试，并对NO生成抑制活性高的洗脱液进一步分离精制得到活性物质。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述的步骤1)优选丙酮提取浓度为70％。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于所述的步骤3)优选用Sephadex LH-20层析柱进行分离，用甲醇、丙酮洗脱。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于所述的步骤3)依次用50％甲醇、70％甲醇、甲醇、丙酮洗脱。
10.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述的步骤4)优选为用CHP-20层析柱和/或HPLC进行精制。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于所述的步骤4)精制方法为利用CHP-20层析柱分离中用甲醇洗脱；HPLC中流动相用TFA-甲醇-乙腈。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于所述的步骤4)依次用30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、甲醇洗脱；利用HPLC精制，流动相0.1％TFA-甲醇-乙腈(60∶30∶5)。
13.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述的NO生成抑制活性测试是利用小鼠巨噬细胞系RAW264.7进行分析的，供试品浓度为100μg/ml。
14.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述的的毒性作用是通过MMT细胞毒性试验进行分析的。
15.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述的的活性物质是从栎精-3-O-(2″，3″-二棓酰基)-β-D-吡喃半乳糖苷、栎精-3-O-(2″-棓酰基)-β-D-吡喃半乳糖苷、1，3，4，6-四-O-棓酰-B-D葡萄糖苷、海棠苷、栎精、3，4-二羟基苯甲酸、藤黄菌素、芹菜素所组成的组中选择的。
全文摘要
本发明公开一种从药用植物猫眼草中分离活性化合物的方法，包含步骤为对猫眼草丙酮提取物进行有机溶剂萃取粗提；对有机溶剂萃取物进行NO生成抑制活性测试，并对NO生成抑制活性高且无毒性作用的萃取物进一步分离；对分离得到的组分进行NO生成抑制活性测试，并对NO生成抑制活性高的组分利用进一步分离精制；对分离得到的单一成分化合物进行NO生成抑制活性测试以及理化特性分析以确定其结构。分离得到的化合物具有抑制NO生成的活性。其中化合物1－3的结构如右式。
文档编号A61K36/47GK1988899SQ200480042279
公开日2007年6月27日 申请日期2004年3月4日 优先权日2004年3月4日
发明者王立岩, 北中进 申请人:学校法人日本大学, 王立岩