专利名称：通过抑制gpvi预防和治疗癌症的方法
通过抑制GPVI预防和治疗癌症的方法
癌症仍然代表对药物的关键挑战之一。今年以来，大量研究已经产生了对具 体类型癌症的特异性疗法的选择。使用特异性疗法所治疗的具体恶性肿瘤的实例是用 Herceptin 治疗的乳腺癌，并且就其他变化形式而言，例如进行性直肠或肺癌，使 用Avastin 治疗，进行性直肠癌或头颈癌，使用Erbitux 治疗，慢性淋巴细胞性 白血病使用MabCampath 治疗，或滤泡性非何杰金淋巴瘤，使用Zeva 1 in 治疗。 而这些特异性疗法中没有一种能够完全替代传统的化疗或外科手术。事实上，大部分新 疗法就其自身而言并非充分有效，因此，需要化疗作为共同疗法。另一方面，化疗不可 避免地带来严重和可能的严重副作用负担。简言之，癌症的治疗选择仍然有限，并且即 使可利用，则与其他威胁生命疾病例如心血管疾病的标准疗法相比，基本上可接受程度 较低。
尽管治疗癌症的治疗选择有限并且与不良副作用相关，但是就一些极具侵害性 的恶性肿瘤而言，病程进展如此之快，以致于诊断时通常已太晚以致于甚至无法根据直 接开始的传统疗法预测合理的有益性。
这些侵害性变化形式之一是恶性皮肤黑素瘤，即一种皮肤癌。已经针对这种黑 素瘤的发展鉴定了几个危险因素。除遗传素质外，皮肤-品质和毛发-颜色也起作用。 最常见的影响是浅肤色的人，即具有光敏类型皮肤。特别的风险是淡红色毛发-颜色的 基因。与具有这些易患病的体质的人的风险相比，深肤色的人发生皮肤癌的风险仅为 10%。这种类型癌症的发展不仅快速，而且所影响的患者数量较大。每年仅在德国就有 大约15.000个新病例，并且约2.000患者死于其后果。这一结果显著高于因其他皮肤肿 瘤导致的全部死亡率，且目前来自黑素瘤的死亡率快速增加，高于任何其他癌症的死亡 率。如果在最早期诊断，则通过完全手术除去原发性肿瘤的长期治愈率仍然较高。然 而，与其他恶性肿瘤相反，在诊断为该病时，它典型地已经通过转移广泛在体内扩散。 然后手术除去再也不可能了，由此迄今为止保持放疗或全身化疗作为唯一的不充分的有 效治疗策略。这种高度的侵害性和转移性使得恶性黑素瘤与其他形式的皮肤癌以及一般 癌症的其他变化形式相比都极具致命性。其他恶性肿瘤在发展阶段的转移类似地对该病 的未来过程具有破坏性。因此，在检测到循环黑素瘤或其他癌细胞的患者中，预后更 差。一旦影响了多个器官，则用目前治疗干预的成功机会就会明显下降。与癌症类型和 具体肿瘤发生转移时的点无关，恶性肿瘤细胞典型地通过血管系统扩散。
血小板在止血和血栓形成过程中起关键作用。它们因其与内皮下胶原蛋白的相 互作用而停止在损害部位并且在那里变活化，从而覆盖损害。胶原蛋白与血小板的相互 作用主要由如下三种受体介导1)主要作用在于使血小板与胶原蛋白粘附的α 2β 1整联 蛋白受体；2)通过Von Willebrand Factor(VWF)间接结合到胶原蛋白受体的GPIb-V-IX ； 和3)GPVI，即信号传导受体，它在结合胶原蛋白时活化血小板。GPVI是免疫受体家族 成员并且在血小板上与:Fc受体Y链CFcRY)共同表达。结合配体的GPVI导致血小板 活化且由此介导血小板聚集(Varga-Szabo D.等人，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.2008， Vol.28 (3)，403-412)。最初α 2 β 1禾Π GPIb-V-IX受体以及GPVI —起被视为预防因心血管疾病或其他疾病导致的动脉血栓形成的富有希望的靶标(Clemetson K.J.等人，2007， Curr.Pharm.Des., vol.13 (26), 2673-2683)) GPVI 是最富有希望的治疗靶标，因为单一 治疗可以导致GPVI长期缺失或抑制(Nieswandt B.等人，J.Exp.Med.2001、Vol.193 (4) 459-469)。
由于血小板和胶原蛋白的相互作用在止血和血栓形成过程中起关键作用，所以 并不令人意外的是，抑制这三种胶原蛋白受体产生抗血栓形成效果。除血小板在血栓形 成和止血方面的功能外，近来还将它们鉴定为癌生长和转移中的重要参与者。由于胶原 蛋白-受体抑制的类似抗血栓形成效果，所以可以预料抑制所述受体在癌生长和转移中 类似的后果。给予阻断α 2β1整联蛋白受体的抗体会支持癌细胞溢出，即增加癌细胞 数量，这可以导致它们离开血流且然后这种阻断增加形成的肿瘤数量(Hangan D.等人， Cancer Res. 1996，Vol.1, 56(13)，3142-3149)。类似地，肺中 B16 黑素瘤转移灶的数量 在VWF-敲除小鼠中高于野生型小鼠，即可以通过用VWF取代小鼠逆转效果(Ternmbe V.等人，J.Thromb.Haemost.2006, Vol.4 (3)，519-526) 因此，预计抑制 GPVI 还可以具 有促进癌症的效果。目前本文概括的数据令人意外地显示相反的结果抑制GPVI不仅 显著减少癌细胞生长，而且减少相应癌细胞转移。
所谓〃抑制GPVI"在本发明中的含义如下GPVI正常功能的任何防止，任何 例如通过防止结合激动剂，或通过配体防止GPVI活化或通过使细胞或细胞碎片表面上的 GPVI失活或不可逆耗尽。
所谓"GPVI抑制剂"在本发明中的含义如下如果对哺乳动物给药则导致如上 述所定义的"GPVI抑制"的任意化合物。
抑制GPVI可以因各种机制、例如因抗-GPVI自身抗体导致的获得性GPVI缺 陷或遗传性先天性缺陷导致，其中GPVI不被表达或以具有缺陷性胞内信号传导和内源性 血小板金属蛋白酶活化的功能失调形式被表达，从而导致胞外域脱落(Arthur J.F.等人， Br.J.Haematol.2007, Vol.139 (3)，363-372)。
本发明GPVI抑制剂的活性成分可以是小化学化合物、肽类、多肽类或单克隆或 多克隆抗体。作为非限制性实例，可以将GPVI抑制剂分类如下
□在结合GPVI时导致GPVI从细胞表面耗尽的GPVI配体，例如抗体及其片 段，例如scFv、Fab、Fv> dAb、Fd或结合GPVI的双抗体，例如
■ JAQ1(EP20010101406)
■ F1232-10-2、 F-1232-21-1、 F-1232-7-1、 F-1232-19-1、 F-1232-37-2、 F-1232-18、 F-1232-17-1、 F-1232-18-3、 F-1232-14-2、 F-1232-24-1、 F-1201-20， F-1232-43-3、 F-1201-18、 F1199-6、 F1232-37-2、 YA-Abs-88、 YA-Abs-03、 F-1249-18-2、 F-1245-7-1、 F-1246-1-1、 F-1249-5-1、 F-1249-20-1、 F-1249-24-1、 F-1249-30-1、 F-1245-5-1、 F-1246-6-2、 F-1249-3-2、 F-1245-4-1、 F-1249-22-1、 F-1251-1-1、F-1257-3-1、F-1232-37-2, F1239-6-1 (W0/2006/118350)
_F1239-l-3、F1239-2-3、F1239-4-2、F1239-5-3、F1239-7-1、F1239-8-1、 F1239-8-1、 F1239-10-2, F1239-11-1、 F1239-15-3、 F1239-16-3、 F1239-17-2、 F1239-18-1、 F1239-19-1、 F1239-22-2、 F1239-22-3、 F1239-23-1(W0/2007/116779)
■ hGP 5C4 (PCT/EP2004/013779)
■ 10B12，16E12, 1C3, 8A1、4H9, 4D 5 (W0/2003/054020)
■ 8M14.3、3F8.1、9E18.3、3J 24.2、6E12.3、1P10.2、4L7.3、7H4.6、 9012.2 (WO 2001/000810)
□导致GPVI蛋白水解失活例如金属蛋白酶失活的GPVI的配体。(Bergmeier W.等人，Thromb.Haemost.2004.Vol.91(5) 951-958)。
□抑制GPVI功能、但不通过防止如下情况导致GPVI从细胞表面耗尽的配体
ο配体受体识别和/或
ο与胞外基质相互作用和/或
ο例如通过用GPVI或其片段掩蔽GPVI胶原蛋白结合位点来与胶原蛋白发生相 互作用(W0/2001/16321、W0/2006/131512、W0/2003/008454、W0/2001/000810、 W0/2000/068377、WO/2000/68377)和 / 或
ο血小板细胞相互作用
□例如通过抑制活化的GPV I引起的信号传导级联减少不依赖于如上所述机制 的GPVI功能的配体
ο例如通过防止涉及胞内信号传导途径的蛋白质例如Syk激酶、c-Src、蛋白激 酶C、磷脂酶C Y 2、份受体γ磷酸化。
本发明的GPVI抑制剂可以通过常规化学合成制备，或就单克隆或多克隆抗体或 片段而言，通过本领域众所周知的重组方法制备(例如，参见Benny K.C.Lo，“ Antibody engineering, methods and protocols, Humana press, 2003)。还可以通过免疫接禾中 GPVI 或GPVI片段使动物的多克隆抗体升高，然后纯化。
在污染分子方面，优选将本发明的GPVI抑制剂纯化至大于80 %纯度，更优选大 于95%纯度，且特别优选药学纯度状态即、大于99.9%纯度，例如，如果GPVI抑制剂是 来自污染大分子的肽或多肽，特别是其他蛋白质和核酸，且不含传染原和致热原。优选 本发明的经分离或纯化的GPVI抑制剂基本上不含其他多肽类。
本发明提供了如本文所述的用于预防和或治疗癌症的GPVI抑制剂，并且还涉及 这种GPVI抑制剂在制备预防和/或治疗癌症的药物中的应用。因此，本发明的另一个方 面提供了药物制剂，包括该抑制剂，其适合于治疗癌症，优选皮肤癌，更优选黑素瘤， 且更优选恶性皮肤黑素瘤。
可以将本发明所述的抑制剂配制成用于治疗用途的药物制剂。可以将经纯化的 蛋白质溶于可以任选加入制成药物制剂的药用赋形剂的常用生理相容性含水缓冲液。
这种药用载体和赋形剂以及适合的药物制剂是本领域众所周知的(例如，参 见“Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins “， Frokjaer 等人， Taylor & Francis (2000)或"Handbook of Pharmaceutical Excipients “，第 3 版，Kibbe 等 人，Pharmaceutical Press O000))。特别地，可以将包含本发明多肽的药物组合物配制成 冻干或稳定可溶形式。可以通过本领域公知的各种方法将多肽冻干。在使用前通过添加 一种或多种药学可接受的稀释剂例如注射用水或无菌生理盐水溶液再溶解冻干制剂。
通过任意药学适合的给药方式递送组合物制剂。各种递送系统是公知的并且可 以用于通过任意便利途径给予组合物。优选通过全身给予本发明的组合物。对全身应用 而言，可以根据常规方法配制用于胃肠外(例如静脉内、皮下、肌内、腹膜内、脑内、肺内、鼻内或透皮)或肠(例如口服、阴道或直肠)递送的本发明治疗蛋白。最优选的给 药途径是基于多肽类的GPVI抑制剂的静脉内给药。可以通过输注或通过快速浓注(bolus injection)连续给予制剂。一些制剂包括缓释系统。
就基于小分子而言的GPVI抑制剂，口服给药是最优选的给药方式。用于口服 给药的片剂和胶囊可以包含常用赋形剂例如粘合剂、填充剂、润滑剂和湿润剂等。口服 液体制剂可以是水或油混悬液、溶液、乳剂、糖浆剂、酏剂等形式，或可以将它们制成 用水或其他适合载体再溶解使用的干燥产品。这种液体制剂可以包含常用添加剂，例如 助悬剂、乳化剂、非水载体和防腐剂。
适合于局部施用的制剂可以是水或油混悬液、溶液、乳剂、凝胶或优选乳剂软 膏剂形式。用于喷雾施用的制剂可以是可喷雾液体或干粉。
以治疗有效剂量对患者给予本发明的GPVI抑制剂，即足以产生期望效果、预防 或减轻所治疗疾病或适应征的严重性或扩散的剂量，但不是产生不可耐受的不良副作用 的剂量。确切剂量取决于许多因素，例如适应征、制剂和给药方式并且必须在前期临床 和临床试验中对每一相应适应征确定。
可以将本发明的药物组合物单独给予或与其他治疗剂联合给予。可以将这些活 性剂作为组成部分掺入同一药物。
本发明的另一个方面在于包含一种或多种分离的GPVI抑制剂的组合物在制备用 于同时、分别或依次用于癌症疗法、优选皮肤癌疗法、甚至更优选治疗黑素瘤的药物制 剂中的应用。
本发明的另一个方面在于可通过实施例3所述方法鉴定的抑制剂在抑制也是 GPVI信号传导级联下游的成分中的应用。
本发明的另一个实施方案在于鉴定GPVI抑制剂的方法，该方法包括下列步 骤
a)将适量的可能的GPVI抑制剂加入到哺乳动物、优选获自人或标准实验室动物 种类例如小鼠的富含血小板的血浆中；
b)任选将步骤(a)的富含血小板的血浆与可能的GPVI抑制剂一起温育；
c)通过添加胶原蛋白相关肽或coimibdn或胶原蛋白来启动血小板聚集，以通过 GPVI-介导的信号传导诱导血小板聚集；
d)比较如步骤(c)中测定的聚集与将胶原蛋白相关肽或coimibdn或特异性较低 胶原蛋白加入到富含血小板的血浆中、但不加入步骤(a)的可能的GPVI抑制剂时得到的聚集。
如果如步骤(a)中所述的当加入可能的GPVI抑制剂时，血小板聚集受到损害， 则该化合物是本发明的GPVI抑制剂。可以在对照实验中进一步测试这种GPVI抑制剂的 特异性，其中将GPVI抑制剂施用于富含血小板的血浆，优选自如第一步中那样的相同的 生物体，但其中GPVI缺陷。可以通过GPVI的遗传缺陷例如GPVI敲除小鼠(Kato K， Kanaji T，Russell S，等人，Blood.2003 ； 102 1701-1707)或通过导致 GPVI 活性基本上 下降例如使基因沉默或例如SiRNA这样的技术实现这种缺陷。这种缺陷可能不一定需要 是完全的。如果用替代的激动剂而非胶原蛋白相关肽、coimibdn或特异性较低的胶原蛋 白、通过其他非GPVI的受体例如ADP、凝血酶或花生四烯酸等活化血小板诱导聚集时，6加入的化合物仍然损害这种制剂的聚集，则该化合物(尽管它抑制GPVI)对GPVI没有特异性。
本发明的另一个方面在于包含一种或多种分离的GPVI抑制剂的组合物在制备同 时、分别或依次用于癌症疗法、优选皮肤癌疗法、甚至更优选治疗黑素瘤的联用药物制 剂中的应用。
本发明的另一个方面在于包含一种或多种分离的GPVI抑制剂和至少另一种治疗 化合物的组合物，所述的另一种治疗化合物不是GPVI抑制剂，该组合物用于同时、分别 或依次用于癌症疗法、优选皮肤癌疗法、甚至更优选治疗黑素瘤。
本发明的另一个方面在于包含一种或多种分离的GPVI抑制剂和至少另一种治疗 化合物的联用组合物，所述的另一种治疗化合物不是GPVI抑制剂，该组合物用于同时、 分别或依次用于癌症疗法、优选皮肤癌疗法、甚至更优选治疗黑素瘤。
因为GPVI抑制具有经证实的抗血栓形成效果并且已经证实其不会导致出血风 险，所以使用GPVI抑制剂的治疗干预可以对不一定面临增加的出血并发症风险的患者、 例如进行常规外科手术的癌症患者具有特别的有益性。
特别是对癌症患者而言，GPVI抑制可以因抗血栓形成和抗癌效果而具有协同作 用。因此，甚至对患有血栓形成风险增加的癌症患者也是如此。
图
图1 静脉内给予5xl04 B16细胞后2周与阴性(载体治疗的)对照组相比通过 GPVI抑制在小鼠中癌症发生率的减少。
图2 静脉内给予IxlO6Bie细胞后2周载体治疗的小鼠的肺。
图3 静脉内给予IxlO6 B16细胞后2周使用GPVI抑制的小鼠的肺。
图4 静脉内给予1.5xl06 B16细胞后2周肺集落的数量(n = 5-10/组，各结 果，线连接的组平均值)。
图5 B 16注射前或之后用载体(阴性对照)治疗后或GPVI抑制有限期限后 Β16输注小鼠的存活率(n = 9-10/组)。
图6 Β16注射前或之后用载体(阴性对照)治疗后或GPVI抑制有限期限后Β16 输注小鼠的体重(平均值，η = 9-10/组)。实施例
实施例1
第一组实验的目的在于评价以三种不同细胞数量静脉内注射Β16细胞后用结合 到GPVI的单克隆抗体JAQl治疗C57BI6小鼠是否可以预防肺中Β16黑素瘤集落生长。
按照如下方式完成用于测试该推定的模型。为了使癌细胞增殖，在无菌条件下 由购自美国模式培养物保藏中心(American Type Culture Collection) (ATCC)的深度冷冻储 备溶液制备B16细胞。缓慢融化细胞，用培养基重新混悬。用色氨酸蓝检查IxlO6 B16 细胞的存活率。就第一次增殖而言，将它们经皮下注入C57BI6小鼠。2周后，取出得 到的皮下肿瘤，用胶原酶分离肿瘤细胞。在体外再次增殖细胞。简言之，将分离的细胞 转入充满相应介质的培养皿。一旦细胞增殖到可目视检测的阶段，则使用胰蛋白酶使粘 连细胞移动。在该阶段，照此进行另一体外增殖，或将细胞经静脉内注入C57BI6测试小鼠尾静脉，以测试GPVI抑制剂的治疗效果。将小鼠(ChariesRiver)保持在标准放置条 件下。这种皮肤癌动物模型的关键终点如下
1)发现具有肿瘤的治疗组中的动物百分比(发生率)；
2)死亡率(死于肿瘤或发现濒临死亡的动物数量并且处死)；
3)在相应治疗组中每只动物肺上发现的肿瘤和转移灶的平均数量。
尽管肿瘤也在皮肤中生长，但是它们在小鼠肺上可以得到最佳定量，这是因肿 瘤的深棕色与黑色之间的反差代表与浅色肺组织的强烈反差的情况所致。针对深色皮肤 的背景，这种分析的可靠性可能较低。此外，大部分注射的细胞被俘获在肺微血管系统 中，与血管内皮粘着。
测试小鼠的治疗方案如表1详细描述。JAQl或盐水(作为阴性对照)载体的剂 量对全部小鼠而言均相同。治疗在注射B16细胞之前4或1天开始，如表1详细描述的 持续进行。给小鼠注射三种不同数量的B16细胞5xl04、IxlO6或1，5xl06。约2周 后，处死动物，测定肺中B16集落的数量。用JAQl单一治疗耗尽了 GPVI达约5天的延 长期限(Nieswandt B.等人，J.Exp.Med.2001、Vol.193 (4) 459-469) 选择的重复短间 隔方案确保GPVI的耗尽在本实验过程中完成。
表1 治疗组[
权利要求
1.(1.)GPVI抑制剂在制备用于预防和/或治疗癌症的药物中的应用。(2.)用于预防和/或治疗癌症的GPVI抑制剂。(3.)权利要求1的应用或权利要求2的用于预防和/或治疗癌症的抑制剂，其中GPVI 是人GPVI。(4.)权利要求1和3的应用或权利要求2和3的用于预防和/或治疗癌症的抑制剂， 其中所述癌症类型是皮肤癌。(5.)权利要求1、3和4的应用或权利要求2和4的用于预防和/或治疗癌症的抑制 剂，其中所述癌症类型是黑素瘤。(6.)权利要求1和3-5的应用或权利要求2-5的用于预防和 其中所述癌症类型是恶性皮肤黑素瘤。(7.)权利要求1和3-6的应用或权利要求2-6的用于预防和 其中GPVI抑制剂是抗体。(8.)权利要求1和3-7的应用或权利要求2-7的用于预防和 其中GPVI抑制剂是单克隆抗体JAQ 1。(9.)权利要求1和3-6的应用或权利要求2-6的用于预防和 其中GPVI抑制剂是小分子。(10.)包含一种或多种分离的GPVI抑制剂的组合物在制备用于同时、分别或依次用于 癌症疗法的药物制剂中的应用。(11.)包含一种或多种分离的GPVI抑制剂的组合物在制备用于同时、分别或依次用于 皮肤癌疗法的联用药物制剂中的应用。(12.)组合物，其包含一种或多种分离的GPVI抑制剂和至少另一种不是GPVI抑制剂 的治疗化合物，它们同时、分别或依次用于癌症疗法。(13.)联用组合物，其包含一种或多种分离的GPVI抑制剂和至少另一种不是GPVI抑 制剂的治疗化合物，它们同时、分别或依次用于皮肤癌疗法。(14.)鉴定GPVI抑制剂的方法，包括下列步骤a)将适量的可能的GPVI抑制剂加入到哺乳动物的富含血小板的血浆中；b)任选将步骤(a)的富含血小板的血浆与可能的GPVI抑制剂一起温育；c)通过添加胶原蛋白相关肽或coimibdn或胶原蛋白启动血小板聚集，以通过 GPVI-介导的信号传导诱导血小板聚集；d)比较如步骤(c)中测定的聚集与将胶原蛋白相关肽或coimilxin或胶原蛋白加入到 富含血小板的血浆中、但不加入步骤(a)的可能的GPVI抑制剂时得到的聚集。/或治疗癌症的抑制剂， /或治疗癌症的抑制剂， /或治疗癌症的抑制剂， /或治疗癌症的抑制剂，
全文摘要
本发明提供了用于预防和或治疗癌症的GPVI抑制剂并且还提供了这种GPVI抑制剂在制备预防和/或治疗癌症的药物中的应用。本发明的另一个方面是包含GPVI抑制剂的药物制剂，其适合于治疗癌症，优选皮肤癌，更优选黑素瘤，且更优选恶性皮肤黑素瘤。
文档编号C07K16/30GK102026659SQ200980114449
公开日2011年4月20日 申请日期2009年4月20日 优先权日2008年4月22日
发明者B·涅斯万德特, U·克洛恩塔勒 申请人:Csl百灵有限公司