专利名称：用于预防、治疗骨健康相关疾病的新的黄酮醇化合物、榆树的生物活性提取物/级分及其 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物组合物领域，其提供从天然来源分离的新的黄酮醇化合物、新的植物提取物、其级分(fraction)和纯化合物，它们可用于预防和/或治疗与依赖或不依赖 雌激素的疾病或综合征或失调相关的各种医学适应症，优选地用于预防或治疗在人类和动 物中引起的依赖或不依赖雌激素的疾病或综合征或失调，以及在人类和动物的骨骼生长 和健康过程中达到峰值骨量(PBM)。特别地，本发明还涉及由榆科(Ulmaceae)植物榆树 (Ulmus wallichiana)制备生物活性提取物、级分和分离纯化合物的方法，其药学上可接受 的盐和组合物是本发明的重要方面。
背景技术：
已被定义为“低骨量状态”的骨质疏松症是社会上的一个主要的老龄化问题。骨 质疏松症是特征为骨组织微细结构损伤的代谢疾病，导致人口老年成员的骨脆性增加和随 后的骨折风险增加。骨质疏松骨折的发生最常见于脊柱、髋关节、末端桡骨和肋骨。相比男 性，女性中的风险较高，且在50岁后急剧增加。导致骨质疏松症的因素包括家族史、遗传因 素、激素因素、营养不足和某些药物的摄入、不运动(immobility)和疾病。患有严重骨质疏 松症的个体的生活质量受到严重影响。已知50岁以上的> 50%的女性和30%的男性受到 影响。在女性中，在绝经后也立即有加速的骨质损失率并且持续不等的年数。南亚妇女中，达到低PBM的普遍程度和骨质疏松症之间存在公认的联系 (S. Adami. Osteoporosis Int.，1 :S27_30，1994)。PBM被定义为由于正常增长而达到的最 高骨量水平。对于骨健康，青春期是整个生命期间最关键的时期，因为超过一半的PBM在青 少年期间积累。在生命的这较早几年中，骨形成大于骨再吸收，因此骨量增加。在成年早 期达到的PBM是至少直至70岁的骨骼脆弱的重要决定因素(L. A. Soyka, W. P. Fairfiled, A. Klibanski. J Clin Endocrinol Metab，11 :3951_3963，2000)。在达到 PBM 之后，再吸收 快于形成，因此骨量减少。虽然逐渐的骨质损失对于老化是正常的，但是正是那些没有达到 最佳PBM者和/或骨质损失加速者具有最大的骨质疏松风险。此外，低PBM容易增加脆弱 性骨折的风险。因此，由于在年轻时具有高PBM的个体可能在老年时具有高骨量，在骨骼生长时 增加PBM的药剂是预防骨质疏松症的理想的目标。完成线性生长后，PBM出现数年，因为骨 矿物质增加在这个时期后继续，虽然达到PBM的精确时间不确定，且在骨骼部位之间各不 相同。股骨的面骨量密度(BMD)在20岁左右达到峰值，而最大总骨量发生于6-10年后，恰 好在生长激素(GH)的合成代谢作用停止之后。大部分用于骨质损失疾病的药物制剂包括钙、维生素D及其类似物、降钙素、二膦 酸盐、雷洛昔芬、激素替代疗法(HRT)等，它们通过降低骨再吸收率从而减缓骨质损失率而 起作用。这种抗再吸收剂的适时施用阻止骨损失。激素替代疗法尽管可有效预防妇女卵巢切除或绝经期后的骨质损失，但与以下疾 病的风险增加有关子宫内膜增生和癌[Grady，D. Grebretsadik, Τ. Ernestwr, V. Petitti,D. Gynecol. 85,304-313 (1995) ， Beresford S. A. Weiss, N. S. Voigt, L. F. McKnight, B. Lancet 349，458—461 (1997)]、乳腺癌[Riggs, L. Hartmann, L. C. J. Med. 348，618—629， (2003)]和血栓栓塞性疾病[Delmas, P. D. Lancet 359，2018-2026 (2002)]。钙治疗的副作用是肾结石的发展。使用降钙素的主要缺点是成本高。快速抗药反 应(Tachyphylaxis)可能在降钙素治疗的一些个体中发生。二膦酸盐吸收差，并可能导致胃肠道刺激、腹泻和便秘。据报道，雷洛昔芬增加 潮热、深静脉血栓形成、肺栓塞和腿抽筋的发生率[Clemett, D. ；Spencer, C. Μ. Drugs 60， 380-409(2000)]ο与达到PBM有关的因素包括先天性、饮食、激素、身体活动、生活方式、药物和疾 病。目标在于提高PBM的治疗干预仍然仅限于控制如雌激素状态、膳食钙摄入和身体活动 等因素。钙摄入量似乎与所谓的临界摄入量(1000毫克/天)有关，但较高的限额似乎并 没有提供额外的优势。运动只影响机械应力下的骨骼区域。雌激素施用只在特征为严重雌 激素过少(hypoestrogenism)的情况下是可行的。显然，营养缺乏是南亚人中、特别是那些 在生命的后期更容易出现骨质损失的女性中PBM不足的主要原因之一。因此，促进PBM的 药剂对于骨损失疾病具有治疗意义。对于这些疗法的使用，它们的相关副作用表明对于预防和治疗骨质疏松症和不能 达到PBM需要替代方案。传统医学是在将现代科学应用于健康之前在人类社会中存在的古老的医学实践。 传统医学作为初级卫生保健来源的重要性由世界卫生组织(WHO)在1976年通过在全球 提出其传统医学计划而首次正式承认。在传统医学中，有许多具有治疗骨疾病的潜力的 天然粗制药物。然而，除了依普黄酮(ipriflavoneM已临床用于这种适应症的一种天然 的产品衍生物)之外，没有报道更多的评估其可能的发展和使用的实验室工作[Fujita， Τ. ；Yoshikawa, S. ；0no, K. ；Inoue, T. ；Orimo, H. J. Clin. Exp. Med. 138,113-141 (1986), Passeri, Μ. ；Biondi, M；Costi, D. ；Bufalino, L. ；Castiglione, g. N. ；DiPeppe, C；Abate, G. Bone Miner. 19 (Suppl. 1)，S57-62 (1992)]。据认为，草药容易获得、更便宜且比化学 合成药物更安全。在印度，阿育吠陀(ayurvedic)医学在印度出现奥义书(Upanishad)、 佛教和其他学派的哲学的过程中出现。草药在阿育吠陀医学中发挥重要作用。一种这 样的阿育吠陀草药是榆树Planchon。在Kumaon和附近，传统治疗师使用这种植物用于 促进骨折愈合[Gaur, R.D.Flora of District Garhwal, North West Himalaya. Trans Media, Srinagar (Garhwal), India, 1999, 第 86 页；Arya, K. R. ；Agarwal, S. C. Indian J. Traditional Knowledge，印刷中]，但对于骨质疏松症和总体骨健康(osteo-health)及 相关疾病的影响并没有科学探索。因此，迫切需要发现和开发有希望的草药产品或基于单一生物活性分子的药物或 植物起源的纯和生物活性分子的混合物，其在实验动物和人类中显示有希望的骨合成代谢 或骨形成活性。榆树是一个用于研究和探讨有关其提取物、级分和纯生物活性标记成分的 骨形成响应的真正潜力的合适的例子。实验表明，其粗提取物、丙酮可溶级分和从该提取物 和级分分离的纯化合物显示有希望的骨形成活性。榆树Planchon属于榆科，分布于从阿富汗至尼泊尔的喜马拉雅山脉[Jain，S. K 编著白勺 Dictionary of Indian Folk Medicine andEthnobotany, Deep Publications,Paschim Vihar，New Delhi，India，1991，第183页]。该植物的叶子用作饲料，树皮产生强力纤维。在印度,这种植物在Kumaon和Garhwal Himalaya发现，在当地被称为Chamarmou， 是可长到35米高的落叶树。到目前为止，对这种植物还没有进行化学和药理学研究。发明目标本发明的主要目标是从榆树制备可用于控制或预防或治疗骨疾病的新的化合物、 生物活性提取物/级分。本发明的另一目标是确定生物活性提取物/级分的标记化合物。本发明的再另一目标是提供分离各成分的方法。本发明的又另一目标是提供一种药物组合物，其用于预防或治疗在人类和动物中 引起的依赖或不依赖雌激素的疾病或综合征或失调，以及在人类和动物的骨骼生长和健康 过程中达到峰值骨量(PBM)。发明_既述本发明涉及药物组合物领域，其提供从天然来源分离的新的黄酮醇化合物、新的 植物提取物、其级分和纯化合物，它们可用于预防和/或治疗与依赖或不依赖雌激素的疾 病或综合征或失调相关的各种医学适应症，优选地用于预防或治疗在人类和动物中引起的 依赖或不依赖雌激素的疾病或综合征或失调，以及在人类和动物的骨骼生长和健康过程中 达到峰值骨量(PBM)。特别地，本发明还涉及由榆科植物榆树制备生物活性提取物、级分和 分离纯化合物的方法，其药学上可接受的盐和组合物是本发明的重要方面。
图1 显示从榆树茎皮提取、分级和分离粗制提取物和纯级分的流程图。图2 榆树的乙醇提取物降低大鼠中的Ovx诱导的骨质损失。在切离的骨中通过 DEXA测量BMD (骨量密度)。用750mg/kg体重的C002治疗90天的Ovx大鼠与用载体(对 照)治疗的Ovx大鼠和假手术(sham operated)的大鼠比较。(A)股骨球(Femur global), (B)股骨颈(femur neck), (C)股骨轴(femur shaft)，和(D)第四腰椎(fourthlumber vertebra)(与假手术大鼠的 BMD 相比，< 0. 001, **_P < 0. 01，*_P < 0. 05 ；与 ovx 对照的 BMD 相比，a-P < 0. 001，b_P < 0. 01，c_P < 0. 05)。图3 在子宫水平上，榆树的乙醇提取物在大鼠中不是雌激素性的。用750mg/kg体 重的C002治疗90天的大鼠的子宫重量与对照假手术的大鼠和Ovx大鼠比较。与假手术对 照大鼠的子宫重量相比，< 0. 001，< 0.01, *-P < 0. 05 ；与ovx大鼠的子宫重 量相比，c-P < 0. 001，b-P < 0. 01，a-P < 0. 05。图4 榆树的乙醇提取物和级分促进未成熟大鼠的PBM。在切离的骨中通过DEXA测 量 BMD (骨量密度)。(A)用 750mg/kg 的 C002 和 50mg/kg 的 914/F006 (914/C002 的级分) 治疗的生长的雌性大鼠股骨与用载体(对照)治疗的大鼠比较。(B)对照大鼠和用750mg/ kg 的 914/C002 治疗的大鼠的第四腰椎。(_-P < 0. 001，**_P < 0. 01，*-P < 0. 05)。图5 榆树的乙醇提取物和级分增加未成熟大鼠中的骨祖细胞。用750mg/kg的 914/C002治疗的生长的雌性大鼠的BMC(骨髓细胞)与用载体(对照)治疗的大鼠比较。 (A)碱性磷酸酶试验(对于成骨细胞的分化)，(B)茜素红-S染色的细胞的显微照片(对 于成骨细胞的矿化作用)，和(C)提取后茜素红染色的量化(***_P < 0. 001，**-P <0.01,*-P < 0. 05)。图6 来自榆树的4种纯化合物在体外促进颅骨成骨细胞的分化。用1和IOOnM浓 度的K012、K058、K068和KlOO处理颅骨成骨细胞，并定量ALP (碱性磷酸酶)的产生。***_Ρ
<0. 001，**-Ρ < 0. 01，*-Ρ < 0. 05 ；N = 3。图7 来自榆树的4种纯化合物在体外促进颅骨成骨细胞的矿化。用1和IOOnM浓 度的Κ012、Κ058、Κ068和KlOO处理颅骨成骨细胞。(A)茜素红-S染色的成骨细胞的显微 照片。(B)提取后茜素红染色的量化< 0. 001，< 0. 01，*-Ρ < 0. 05)。(C)通 过von Kossa法染色的成骨细胞的显微照片。图8 :K058促进颅骨成骨细胞的增殖。用1和IOOnM浓度的Κ058处理颅骨成骨细 胞，并进行 BrdU 细胞增殖试验。***_Ρ < 0. 001，**_Ρ < 0. 01, *_Ρ < 0. 05 ；N = 3。图9 来自榆树的4种纯化合物在体外促进BMC (骨髓细胞)的矿化。用1和IOOnM 浓度的Κ012、Κ058、Κ068和KlOO处理BMC，并进行矿化。(A)茜素红-S染色的细胞的显微 照片。(B)提取后茜素红-S染色的量化(***_Ρ < 0. 001，**-Ρ < 0.01, *-Ρ < 0. 05)。图10 :Κ068和KlOO抑制3T3-L1鼠的前脂肪细胞的成脂分化。(A)用1 μ MUOOnM 和InM浓度的Κ068和KlOO处理3T3-L1细胞，并进行油红0染色。提取和量化染色。
<0. 001，**-Ρ < 0· 01，*-Ρ < 0· 05 ;Ν = 3。(B)在用 IOOnM 禾口 InM 浓度的 Κ068 禾口 KlOO 处 理3T3-L1前脂肪细胞8天(脂肪细胞分化的时间)后，各种脂肪细胞分化特异性基因的半 定量RT PCR0 GAPDH用作RNA负载对照。三个独立实验的代表性的凝胶图片具有类似的结果。
图11 :Κ058提高各种成骨细胞特异性基因的mRNA水平。在不同时间点用IOOnM 的K058处理颅骨成骨细胞后，各种成骨细胞mRNA的半定量RT PCR0 GAPDH用作内部负载 对照。三个独立实验的代表性的凝胶图片具有类似的结果。图12 :K058和Κ012在体外不具备雌激素性(estrogenicity)和抗雌激素性。用 17 β -雌二醇处理的Ishikawa细胞刺激ALP的产生。(A)相比对照，用ICT8M的17 β -雌二 醇处理的细胞中的ALP (碱性磷酸酶)强劲增长。不同浓度的Κ058、Κ012和雷洛昔芬没有 任何反应。(B)在10_8Μ的17 0-雌二醇的存在下，用各种浓度的1(012、1(058和雷洛昔芬处 理的细胞中的ALP水平。图13 :Κ058降低大鼠中的Ovx诱导的骨损失。在切离的骨中通过DEXA测量BMD。 用1. 0和5. Omg/kg的K058治疗90天的Ovx大鼠与用载体(对照)治疗的Ovx大鼠和假 手术的大鼠比较。㈧股骨球，(B)股骨颈，(C)股骨轴，(D)第四腰椎，和(E)胫骨头(与 假手术大鼠的BMD相比，_-P < 0. 001，**-P < 0. 01，*-P < 0. 05 ；与ovx对照的BMD相 比，a-P < 0. 001，b-P < 0. 01，c_P < 0. 05)。图14 在子宫水平上，K058在大鼠中不是雌激素性的。用1. 0和5. Omg/kg体重的 K058治疗90天的大鼠的子宫重量与对照假手术的大鼠和Ovx大鼠的子宫重量比较。与假 手术对照大鼠的子宫重量相比，< 0. 001，< 0. 01，*-P < 0. 05。与ovx大鼠的 子宫重量相比，c-P < 0. 001，b-P < 0. 01，a-P < 0. 05。图15 :K058促进未成熟大鼠中的PBM。在切离的骨中通过DEXA测量BMD。用5mg/ kg的K058治疗的生长的雌性大鼠与用载体(对照)治疗的大鼠比较。显示股骨轴中的 BMD。(***-Ρ < 0. 001，**-P < 0· 01，*-P < 0· 05)。
图16 :K058增加未成熟大鼠中的骨祖细胞。用5mg/kg的K058治疗30天的生长的 雌性大鼠的BMC与用载体(对照)治疗的大鼠比较。㈧碱性磷酸酶试验，⑶茜素红-S染 色的细胞的显微照片，和(C)提取后茜素红-S染色的量化(***_P < 0. 001，**-P < 0.01, *-P < 0. 05)。图17 :K012降低大鼠中的Ovx诱导的骨质损失。在切离的骨中通过DEXA测量BMD。 用1. 0和5. Omg/kg的K012治疗90天的Ovx大鼠与用载体(对照)治疗的Ovx大鼠和假手 术大鼠比较。(A)股骨颈，(B)胫骨球，(C)胫骨头，和(D)胫骨-腓骨分离点，(E)腰椎球， 和(F)第二腰椎(与假手术大鼠的BMD相比，_-P < 0. 001，**-P < 0. 01，*_P < 0. 05 ； 与 ovx 对照的 BMD 相比，a-P < 0. 001，b_P < 0. 01，c_P < 0. 05)。图18 在子宫水平上，K012在大鼠中不是雌激素性的。用1. O和5. Omg/kg体重的 K012治疗90天的大鼠的子宫重量与对照假手术的大鼠和Ovx大鼠的子宫重量比较。(与 假手术对照大鼠的子宫重量相比，_-P < 0. 001，**-P < 0. 01，*-P < 0. 05。与ovx大鼠 的子宫重量相比，c-P < 0. 001，b-P < 0. 01，a-P < 0. 05。)发明详述因此，本发明提供了通式1的黄酮醇化合物，其中，Rl和R2选自H、0H。
权利要求
1.通式1的黄酮醇化合物，其中，Rl和R2选自H、OH
2.根据权利要求1所述的化合物，其从榆树中分离。
3.根据权利要求1所述的化合物，其中，所述化合物用于骨疾病的治疗。
4.用于控制或预防或治疗骨疾病的来自榆树的生物活性提取物/级分，其中，所述提 取物/级分包含通式2的标记化合物
5.根据权利要求4所述的生物活性提取物，其中，所述提取物从包含标记化合物 Κ012(6· 7-9% )、Κ058(3· 3-4. 5% )、Κ068(0· 6-0. 7% )和 KlOO (1· 7-2. 6% )的榆树的醇提取物获得。
6.根据权利要求4所述的生物活性级分，其中，丙酮可溶级分从包含标记化合物 Κ012(7· 9-12% )、Κ058(1· 7-3. 0% ), Κ068 (0. 7-1. 2% )和 KlOO (2. 5-4. 5% )的醇提取物获得。
7.根据权利要求4所述的生物活性级分，其中，醇级分/丙酮可溶级分在雌激素缺乏时 具有骨保护作用。
8.根据权利要求4所述的生物活性级分，其中，醇级分通过增加骨髓中的骨祖细胞增 强达到ΡΒΜ。
9.根据权利要求4所述的生物活性级分，其中，生物活性提取物/级分从选自榆树的茎皮、小枝的植物部分获得。
10.权利要求1所述的通式1的化合物和从榆树获得的权利要求4所述的生物活性提 取物/级分或其标记化合物，单独或其组合，在控制或预防或治疗骨疾病中的用途。
11.根据权利要求10所述的生物活性提取物/级分的用途，其中，醇提取物的有效剂量 的范围为500-750mg/kg，丙酮可溶级分的有效剂量的范围为25mg/kg至100mg/kg
12.根据权利要求10所述的化合物的用途，其中，药学上可接受的盐包括选自钠盐、钾 盐、钙盐、草酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐和酒石酸盐的盐。
13.根据权利要求10所述的用途，其中，在用0.InM至1. 0 μ M的浓度处理的颅骨成骨 细胞中，通式2的化合物Κ012、Κ058、Κ068、Κ100在ALP活性方面显示比对照(载体)提高 70% 至 100%。
14.根据权利要求10所述的用途，其中，在用Κ012、Κ058、Κ068和KlOO处理的成骨细 胞中，发现通式2的化合物比对照(载体)增加10%至25%的新生钙沉积。
15.根据权利要求10所述的用途，其中，通式2的化合物增强BMC的矿化，BMC的矿化 是其在骨骼生长和维持中的成骨作用所需的。
16.根据权利要求10所述的用途，其中，通式2的化合物可以以0.25-1.0(Κ068) 1. 0-5. O(KlOO) 2. 5-7. 5(Κ058) :5. 0-12. 5 (Κ012)的比例结合使用。
17.根据权利要求10所述的用途，其中，通式2的化合物Κ012、Κ058促进成骨细胞增 殖、分化和矿化。
18.根据权利要求10所述的用途，其中，通式2的化合物Κ068和KlOO促进成骨细胞分 化、矿化，且在3Τ3 Ll细胞系中具有抗成脂活性。
19.根据权利要求10所述的用途，其中，通式1的化合物Κ058通过上调促进成骨细胞 功能和抑制破骨细胞功能的各种基因的合成发挥成骨作用。
20.根据权利要求10所述的用途，其中，IOnM至Ι.ΟμM浓度的通式1的化合物Κ058 刺激颅骨成骨细胞半汇合培养物的BrdU掺入达25%至75%。
21.根据权利要求10所述的用途，其中，通式1的化合物Κ058通过上调促进成骨细胞 功能和抑制破骨细胞功能的各种基因的合成发挥成骨作用。
22.—种药物组合物，其单独或组合地包含有效量的权利要求4所述的来自榆树的生 物活性提取物/级分或其通式2的标记化合物，任选地还包含一种或多种药学上可接受的添加剂、载体和稀释剂。
23.根据权利要求22所述的组合物，其中，所述组合物包含单独或组合的选自通式1 代表的K012、K058、K068和KlOO的化合物，任选地还包含一种或多种药学上可接受的添加 齐U、载体和稀释剂。
24.根据权利要求22所述的药物组合物，其中，所使用的稀释剂选自淀粉、乳糖、磷酸二钙。
25.根据权利要求22所述的药物组合物，其中，润滑剂形式的药学上可接受的添加剂 选自单独或适当组合的滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙或steorotes、固体聚乙二醇、十二烷基硫 酸钠或任何其他类似性质的成分。
26.根据权利要求22所述的药物组合物，其中，对于醇提取物以至少500至750mg/Kg 体重、对于丙酮可溶级分以25至10100mg/Kg体重的单位剂量施用所述组合物的剂量。
27.根据权利要求22所述的药物组合物，其中，醇提取物(C002)源自榆树，在雌激素缺 乏时具有骨保护作用，在子宫水平上没有雌激素拮抗作用，在发育的雌性大鼠中通过增加 骨髓中的骨祖细胞增强达到PBM。
28.一种治疗受试者的骨疾病的方法，其中，所述方法包括向需要的受试者施用权利要 求22所述的药物组合物的步骤。
29.根据权利要求28所述的方法，其中，所述药物组合物可以通过口服、静脉内、皮下、 腹膜内或肌肉内途径施用。
30.一种由榆树制备提取物/级分和通式2的化合物的方法，其中，所述方法包括(a)获得榆树植物，(b)粉碎植物材料，(c)在室温下用质子溶剂提取粉碎的植物材料，(d)过滤提取物，(e)减压浓缩提取物，(f)用己烷研磨提取物，以除去非极性组分，(g)真空干燥残留物以获得自由流动的粉末而产生所需的提取物，(h)用水溶解步骤(g)中获得的提取物，(i)通过添加正丁醇沉淀水提取物， (j)过滤白色沉淀以获得K058，(k)用甲醇和乙酸乙酯的混合物结晶化合物， (1)过滤化合物，(m)干燥化合物以获得自由流动白色粉末状的K058， (η)浓缩滤液并用丙酮研磨，(ο)通过常规的色谱方法从丙酮可溶级分分离化合物Κ012、Κ068和Κ100， (P)量化提取物和丙酮可溶级分中的Κ058、KO12、Κ068、Κ100。
31.根据权利要求30所述的方法，其中，用于提取的醇选自甲醇、乙醇、丙醇或其适当组合。
32.根据权利要求30和31所述的方法，其中，用于研磨的溶剂选自丙酮、乙基甲基酮、 二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇或其适当组合。
全文摘要
本发明提供可用于控制或预防或治疗骨疾病的来自榆树的黄酮醇化合物和生物活性提取物/级分及其提取方法。所述提取物/级分包含通式2的标记化合物，K058R1＝R2＝OH，K012R1＝R2＝OH，2，3双键，K068R1＝R2＝H，K100R1＝OH，R2＝H，其中，醇提取物中的标记化合物K012、K058、K068、K100的范围分别为6.7-12％、1.7-4.5％、0.6-1.2％、1.7-4.5％。根据本发明的另一方面，提供了包含上述化合物的药物组合物。本发明还提供一种通过口服、静脉内、皮下、腹膜内或肌肉内途径施用所述药物组合物治疗骨疾病的方法。
文档编号C07D309/10GK102007110SQ200980113792
公开日2011年4月6日 申请日期2009年3月3日 优先权日2008年3月5日
发明者G·K·杰恩, G·斯瓦恩卡, G·米沙, J·A·希迪奎, K·R·阿尔亚, K·沙兰, L·马尼卡瓦萨加姆, N·查托帕德亚, P·拉瓦特, R·莫尔亚 申请人:科学与工业研究委员会