玉米aba信号基因及使用方法

专利名称：玉米aba信号基因及使用方法
技术领域：
本发明包含用于对植物进行基因修饰，特别是用于调节植物对脱落酸的响应的组 合物和方法。
背景技术：
脱落酸(ABA)是在多种生理过程中发挥基本调控作用的植物激素，所述生理过程 包括胚的发育、种子休眠、蒸腾和对环境胁迫的适应。ABA调控许多植物发育的农艺学上重 要的方面，包括种子贮藏蛋白和脂类的合成以及气孔关闭的调节。ABA响应启动子的分析已 揭示了不同的潜在顺式作用调节元件。影响ABA生物合成和信号传送(signaling)的基因中的突变在在一些植物种类中 是己知的。参见，例如 Leung and Giraudat, (1998)Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.49 :199-222，以及其中引用的参考文献。在拟南芥(Arabidopsis)中，已鉴定出大量 遗传学差异的拟南芥酸不敏感基因座。这些突变体是基于种子在抑制性浓度的ABA存在下 发芽的能力进行选择。还表明突变能影响种子发育的某些其他方面，包括贮藏蛋白和脂类 的累积、叶绿素分解、耐脱水性和胚的成熟。此外，ABA介导的生长控制是植物对不利环境 条件的基本响应。需要调节植物对ABA的响应，特别是用于减轻非生物胁迫对营养和/或 生殖生长的影响从而保持或增加产量的方法。发明概述提供了用于增加植物特别是种子植物产量的组合物和方法。本方法涉及调节脱落 酸(ABA)识别和信号转导以保护植物免受胁迫和不利环境条件的有害影响。组合物包含影 响植物或植物细胞中ABA敏感性的基因构建体。特别感兴趣的是ABA相关序列。这些序列 包括参与ABA识别和信号转导的基因的突变体、片段和变体以及反义核苷酸序列。DNA序列 可以提供在构建体中，所述构建体提供时间特异性、发育特异性和/或组织特异性。组合物 在用于增加胁迫下特别是非生物胁迫下的植物产量的方法中是有用的。这样，除去了 ABA 对植物生长和/或产量的有害影响。还提供了转化的植物、植物细胞、组织和种子。附图简要描述

图1显示了如下文实施例7进一步所述的ABIl转基因玉米的产量数据。图2是拟南芥和玉米(Zea mays)ABIl蛋白的比对。图3提供了 SEQ ID NO 12中鉴定出的玉米基因的信息。序列简要描述SEQ ID NO :1和2中提供了拟南芥ABIl序列。SEQ ID NO :3和4中提供玉米ABIl 核酸和氨基酸序列。SEQ ID NOS :5、6和7中分别提供了部分ZmABIl同源物A、B和C。SEQ ID NOS 8和9中分别提供了 ZmABI-GF和同源物，SEQ ID NO 10中提供ZmABI-GF的氨基 酸序列。SEQ ID NO 11和12是本文进一步所述的突变ZmABIl序列。SEQ ID NO 13是在 启动子区具有ABRE (ABA响应元件)的ABA诱导型基因的基因组序列；还可参见图3。发明详细描述提供了调节植物对脱落酸(ABA)响应的方法。在某些实施方案中，通过除去ABA对种子发育的有害影响保持作物产量。特别是，本发明包括用于破坏或延缓ABA信号传送 或功能的组合物和方法。对于以组织优选的和/或发育优选的方式破坏或延缓ABA的功 能或作用从而使营养和/或生殖组织与胁迫和不利环境条件隔离，本组合物和方法是有用 的。这可以有利地改变某些组织的发育时间段以便最小化非生物胁迫的影响。例如，可以 改变胚乳发育的某些方面的时间以避免非生物胁迫的负面影响。出于本发明的目的，“种子发育”包括但不限于生殖组织的发生和发育、胚乳发育 和种子成熟。ABA参与贯穿植物生命周期的很多生理和发育过程，包括种子休眠；对例如寒冷、 干旱、盐度等非生物环境胁迫的适应；营养贮藏物质的累积；耐脱水性的获得；气孔关闭 等。ABA介导植物对例如干燥、寒冷、盐胁迫等环境信号和其他胁迫的适应性，并且作为负 面生长调节物。通常，ABA通过调节细胞电位来扩大，可能通过膨胀控制(turgor control) 以及通过诱导有丝分裂生长抑制(mitotic growth arrest)来强制行使双峰(bimodal)负 面生长控制。本发明的某些实施方案包括控制或调节植物对ABA信号的响应。“调节”意指上调 或下调植物对ABA的响应。出于本发明的目的，调节通常是通过ABA合成的破坏和/或ABA 的识别和/或信号转导的破坏下调植物响应。应当意识到，植物中ABA功能的全部破坏是 不实际的，因为ABA在植物发育中发挥很多有用的作用。本发明的某些实施方案破坏了 ABA 在最终效果(eventual effect)位点的作用，例如花和种子。这样，ABA识别或其信号转导 的破坏提供了使雌性生殖组织生长与胁迫隔离的有效策略。受精时或刚受精后的环境胁迫抑制了库容量(sink capacity)建立中的早期事件 并且能降低产量。例如在谷类中，胚乳是成熟种子中贮藏物质的主要来源。贮藏容量是在 种子发育的早期阶段中建立的。意识到ABA参与植物对胁迫的早期响应，本发明的某些实 施方案包括除去ABA对发育种子的有害影响，改善种子和种子产品特别是谷类(cereal)和 谷物(grain)的性质和数量。参见 Mambelli and Setter, (1998)Physiologia Plantarum 104 :266-72 禾口 Tuberosa，et al. , (1998)Theor. Appl. Genet 7:44-55。正如所表明的，本发明的某些实施方案包含将调节ABA识别和信号转导的序列引 入靶植物。“调节ABA识别和信号转导的序列，，和“参与ABA识别和信号转导的序列，，意指 破坏ABA合成或其识别和信号转导的基因及其突变形式。破坏ABA合成或其识别或信号转 导的这些突变体、基因和序列在本文中也称为“ABA相关序列”。这样的序列包括但不限于 ABA不敏感的和高敏感突变体或对应于突变基因或野生型基因的反义序列。ABA突变体为 本领域所已知的并且包括 abil-5、eral-3(Cutler，et al.，(1996) Science 273 1239-41), gcal/8(Benning,et al. ,(1996)Proc. Workshop Abscisic Acid Signal Transduction in Arabidopsis, Madrid, p. 34)、axr2 (Wilson, et al.，(1990)Mol. Gen. Genet. 222 :377_83)、 jarl(Staswick, et al. , (1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 6837-40)> jin4(Berger, et al. , (1996)Plant Physiol. Ill 525-31) > bril (Clouse, et al. , (1996)Plant Physiol. Ill :671_78)(大麦(Hordeum vulgare))、abal (Bitoun，et al.，(1990)Mol. Gen. Genet. 220 :234_39 和 Leydecker, et al.，(1995) Plant Physiol. 107 :1427-31)(皱叶烟 草(Nicotiana plumbaginifolia))等。这些和其他ABA相关突变体可以用于本发明的实 践中。
“对应”于基因或序列意指序列能与基因或序列杂交至干扰转录所需的程度。应当 意识到，取决于本发明所用的ABA相关序列，编码序列或反义序列可以是优选的。但是，编 码序列也可以用于共抑制靶基因的表达。例如，一种策略包括具有早期子粒/胚启动子的 突变abil基因的表达，以压倒性地(dominantly)破坏早期种子形成阶段的组织中ABA的 作用。这样的方法将不会破坏随后在种子成熟中所需的ABA的功能。因此，正如下文更全 面所述的，可以将一些候选基因靶标与具有不同表达模式的启动子结合，从而在面对非生 物胁迫时提供产量增加的稳定性。拟南芥ABA不敏感即ABI突变体是可获得的。这些突变体在种子发育中具有多 方面的缺陷，包括在改变的种子特异性基因表达中对发芽的ABA抑制的敏感性降低。参 B Finkelstein, et al.，(1998)The Plant Cell 10 1043-1045 ；Leung, et al.，(1994) Science 264 1448-1452 ；Leung(1997)Plant Cell 9759-771 ；Giraudat,et al.，(1992) Plant Cell 4 1251-1261 ；Myer, et al. , (1994)Science 264 1452-1455 ；Koornneef, et al. , (1989)Plant Physiol. 90 463-469 ；Nambara, et al. , (1992)Plant J. 2 435-441 ；Finkelstein and Somerville,(1990)Plant Physiol. 94 1172-1179 ；Leung and Giraudat, (1998)Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49 199-222 ；Robinson and Hill, (1999)Plant，Cell and Environment 22 :117_123 ；以及 Rodriguez, et al.，(1998) FEBS Letters 421 :185_190，以及其中所引用的参考文献，在此通过引用将以上全部并入。 其他的ABA相关突变体包括来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的bril，其序列可以见于 Genbank 登录号 AF017056 和 Li，et al.，(1997)Cell 90 :929_938，在此通过引用将两者并 入。感兴趣的abi突变体包括，例如拟南芥abil，即ABIl基因的结构部分中的显性突 变，编码磷酸酶2C(PP2C)蛋白。该突变包含核碱基从鸟嘌呤到腺嘌呤的转变，所述转变将 DNA序列GGC变为GAC，从而引起在SEQ ID NO 2的氨基酸位置180的野生型甘氨酸残基被 天冬氨酸替换(称为 G180D ；Meyer, et al.，(1994) Science 264 1452-1455)。野生型拟南芥ABIl的核酸和氨基酸序列示于SEQ ID N0S:1_2中。也称为PP2C 的野生型玉米(Zea mays) ABIl的核酸和氨基酸序列示于SEQ ID NOS 3-4。该玉米基因与 来自籼稻(Indica rice)的ABIl基因具有高度同源性。SEQ ID NOS :5、6和7中提供了三 个另外的密切相关的玉米同源物的部分序列。SEQ ID NOs :11和12代表与拟南芥G180D突 变体相似的玉米突变体。对于玉米，改变了编码序列，从而将位置193的甘氨酸变为天冬氨 酸。所述突变体的N末端部分中的16-残基缺失(对应于野生型蛋白中的氨基酸22-37) 看起来不影响活性。SEQ ID NOs :8和10中作为ZmABIl-GF提供的是分离自GaspeFlint的并且与来自 粳稻(Japonica rice)的ABI基因具有高度同源性的第二 ZmABIl基因。SEQ ID NO :9中 提供了 ZmABI-GF的另一玉米同源物。以上列出的这些突变体称为“ABA相关突变体”。"ABA相关突变体”意指破坏植物 中ABA信号传送和/或识别的基因和序列。利用以上玉米ABIl序列，可以从包括谷类的其 他植物中分离相关序列。在一些情况下，使用对应于来自感兴趣的靶植物的序列的ABA相 关序列可能是有益的。例如，为了在玉米中使用，可以优选ABA相关序列的玉米同源物或对 应于玉米同源物的序列。
本发明的某些实施方案利用ABA相关序列来控制植物对ABA的响应。通常，在例如 雌性生殖组织的所选组织中阻断ABA信号传送或识别来避免产量损失是有益的。利用ABA 相关序列、编码序列和反义序列，可以控制植物中ABA的表达和识别。正如下文更详细地讨 论的那样，这些序列可以通过重组方法以及常规育种方法引入目的植物。本发明的核苷酸序列可以用于从其他生物中，特别是其他植物中，更特别是谷类 中分离对应的序列。这样，基于这些序列与本领域已知的ABA相关序列的序列同源性，诸如 PCR、杂交等方法可以用于鉴定这些序列。可以根据序列与整个ABA相关序列或其片段的序 列同一性来分离序列。在杂交技术中，已知核苷酸序列的全部或部分作为与来自选定植物的克隆的基因 组DNA片段或cDNA片段的总体(即基因组或cDNA文库)中存在的其他对应的核苷酸序列 进行选择性杂交的探针使用。所述杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或 其他寡核苷酸，并且可以用例如32P的可检测基团或其他任何可检测标记进行标记。因此， 例如可以通过标记基于本发明的ABA相关序列的合成寡核苷酸来制备杂交的探针。杂交 探针的制备方法和cDNA和基因组文库的构建方法是本领域熟知的并且公开于Sambrook， et al.，(1989)Molecular Cloning :A Library Manual (分子克隆文库手册)(2d(第二 版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press (美国冷泉港实验室出版社)，Plainview，New York(纽约))。例如，整个ABA相关序列或其一个或多个部分可以用作能够与对应的序列和信使 RNAs特异性杂交的探针。为了在多种条件下实现特异的杂交，这些探针包括在目的序列 中是独特的并且优选地长度为至少约10个核苷酸的序列。这些探针可以用于通过PCR从 所选植物扩增对应的序列。该技术可以用于从所需植物中分离另外的编码序列或者作为 确定植物中的编码序列是否存在的诊断检测。杂交技术包括涂板DNA文库(plated DNA libraries)的杂交筛选(斑点或集落；参见，例如 Sambrook，et al.，(1989)Molecular Cloning :A Library Manual (分子克隆文库手册)(2d (第二版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press (美国冷泉港实验室出版社)，Plainview, New York(纽约))。这些序列的杂交可以在严紧条件下进行。“严紧条件”或“严紧杂交条件”意指探针 与其靶序列杂交比与其他序列杂交达到的可检测更高(例如至少超过背景2倍)的条件。 严紧条件是序列依赖性的并且在不同情况下是不同的。通过控制杂交的严紧性和/或洗涤 条件，可以鉴定与探针100%互补的靶序列(同源探查(homologous probing))。可选地， 可以调整严紧性条件以允许序列中一些错配，以便可以检测到更低程度的相似性(异源探 查(heterologous probing))。通常，探针的长度少于约1000个核苷酸，优选地长度少于 500个核苷酸。通常，严紧条件会是其中盐浓度小于约1. 5M钠离子，通常约0. 01至1. OM钠离子 浓度(或其他盐类)，pH为7. 0至8. 3并且对于短探针(例如10至50个核苷酸)温度至 少约30°C以及对于长探针(例如多于50个核苷酸)温度至少约60°C的条件。杂交持续时 间通常小于约24小时，通常约4-12小时。严紧条件也可以通过添加诸如甲酰胺的去稳定 剂来实现。示例性的低严紧性条件包括用30-34%甲酰胺、IM NaClU % SDS (十二烷基磺酸 钠)的缓冲液于37°C杂交并且在50-55°C、在IX至2X的SSC(20XSSC = 2. OM NaCl/0. 3M 枸橼酸钠)中洗涤。示例性的中度严紧性条件包括在40-45%甲酰胺、IM NaClU% SDS于37°C杂交，并且在55-60°C的0. 5X至IX的SSC中洗涤。示例性的高严紧性条件包括在 50%甲酰胺、IM NaClU % SDS中于37°C杂交，并且在60_65°C的0. 1 X的SSC中洗涤。特异性通常是杂交后洗涤的作用，关键因素是最终清洗溶液的离子强度和温度。 对于 DNA-DNA 杂交物，Tm 可以用 Meinkoth and Wahl (1984) Anal. Biochem 138 :267_284 的 公式估算:Tm = 81. 5°C +16. 6 (IogM) +0. 41(% GC) -0. 61(% form) -500/L ；其中 M 是一价阳 离子的摩尔浓度，％ GC是DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％ form是杂交溶液中甲 酰胺的百分比，L是碱基对杂交物的长度。所述Tm是50%的互补靶序列与完全匹配的探针 杂交的温度(在规定的离子强度和PH下)。对于每的错配，Tm降低约1°C;因此，可以调 整Tm、杂交和/或清洗条件，以便与所需同一性的序列杂交。例如，如果要求同一性> 90% 的序列，那么Tm可以降低10°C。通常，严紧条件选择为比在规定的离子强度和PH中具体序 列及其互补物(complement)的热解链点(thermal melting point, Tm)低5°C。但是，高严 紧条件可以采用比热熔解点(Tm)低1、2、3或4°C的杂交和/或清洗；中严紧条件可以采用 比热解链点(Tm)低6、7、8、9或10°C的杂交和/或清洗；低严紧条件可以采用比热熔解点 (Tffl)低11、12、13、14、15或20°C的杂交和/或清洗。利用该公式、杂交和清洗组分以及所需 Tm，本领域技术人员应当理解，描述了杂交的严紧性和/或清洗溶液中的内在变化。如果所 需的错配程度导致了低于45°C (水溶液)或32°C (甲酰胺溶液)的Tm，那么优选增加SSC 浓度，以便可以使用更高的温度。对于核酸杂交的广泛指导见于Ti jSSen(1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes (生物化学和分子生物学中的实验室技术-核酸探针杂交)，第I部分，第2 章(Elsevier, New York(纽约))；禾口 Ausubel，et al.，eds. (1995)Current Protocols in Molecular Biology (现代分子生物学实验技术)，第 2 章(Greene Publishing and ffiley-Interscience, New York(纽约))。参见 Sambrook, et al. , (1989)Molecular Cloning :Α Library Manual (分子克隆文库手册)(2d (第二版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press (美国冷泉港实验室出版社)，Plainview, New York(纽约))。因此，本发明包括分离的“对应的ABA相关序列(corresponding ABA-associated sequences) ”，其调节植物对ABA的响应以及在严紧条件下与本文公开的ABA相关序列或其 片段杂交。这些序列与所公开的序列是至少约40 %至50 %同源，约60 %、65 %或70 %同 源，甚至至少约 75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99% 或更高同源。也就是说，序列的序列同一性可以变化，共享至少约40%至50%，约60%、 65%或 70%，甚至至少约 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%、99%或更高的序列同一性。本发明的ABA相关序列可以与组织特异性或发育特异性启动子一起使用从而以 组织或发育特异性的方式破坏ABA功能。特别感兴趣的启动子包括种子优选启动子，特别 是早期子粒/胚启动子和晚期子粒/胚启动子。授粉后子粒发育大致可以分为三个主要时期。子粒生长的停滞期(lag phase)发 生在授粉后约0至10-12天(授粉后天数(days after pollination) (DAP))。在此期间， 子粒在质量上生长不显著，但是进行决定子粒活力(即细胞数目)的重要事件。线性谷物 灌浆期开始于约10-12DAP并且持续到约40DAP。在该子粒发育阶段，子粒几乎达到其最终 质量的全部，并且产生各种贮藏产物(即淀粉、蛋白、油)。最终，成熟期发生在从约40DAP至收获。在该子粒发育时期，子粒变为静止的并且开始脱水为发芽前的长时期休眠做准备。 如本文限定的“早期子粒/胚启动子(Early kernel/embryo promoters)，，是主要在发育 的停滞期驱动表达的启动子(即从约0至约12DAP)。如本文限定的“晚期子粒/胚启动子 (Late kernel/embryo promoters) ”主要从12DAP到成熟期间驱动表达。表达窗可能会有 一些重叠。启动子的选择取决于所用的ABA相关序列以及所需的表型。早期子粒/胚启动子包括，例如ciml，5DAP起作用的花粉和全子粒特异性启动子。 参见，例如WO 00/11177，在此通过引用将其并入。其他早期子粒/胚启动子包括种子优选 启动子endl，其是7DAP起作用的，和end2，其在在全子粒中9-14DAP起作用，以及在胚乳 和果皮10DAP起作用。参见，例如WO 00/12733，在此通过引用并入。在本发明的某些方法 中有用的其他早期子粒/胚启动子包括种子优选启动子ltp2，美国专利第5，525，716号； 玉米Zm40启动子，美国专利第6，403，862号；玉米nuclc，美国专利第6，407，315号；玉米 ckxl-2启动子，美国专利第6，921，815号和美国专利申请公开第2006/0037103号；玉米 Iecl启动子，美国专利第7，122，658号；玉米ESR启动子，美国专利第7，276，596号；玉米 ZAP启动子，美国专利申请公开第20040025206号和第20070136891号；玉米启动子e印1， 美国专利申请公开第20070169226号；以及玉米启动子ADF4，美国专利申请第60/963,878 号，2007年8月7日提交。这些启动子在发育的种子组织中驱动表达。这些早期子粒/胚启动子可以与ABA的识别/信号转导通路中的基因或突变体一 起使用。这样，可操作地连接到早期子粒/胚启动子的诸如abil或abi2的突变基因可以 压倒性地破坏靶组织中ABA的作用，但不会改变随后在种子成熟中所需的ABA功能。可选 地，早期子粒/胚启动子可以可操作地连接到ABA相关序列的野生型(共抑制)或反义核 苷酸序列。早期子粒/胚启动子用于在种子成熟前破坏组织中ABA的作用。将调节ABA识别和信号转导的序列“引入”靶植物包括将感兴趣的序列合并入靶 植物的任何手段。这些手段包括常规育种方法、遗传转化方法或其他可利用的此类方法。本 发明的方法不依赖于将核苷酸构建体引入植物的特定方法，只要所述核苷酸构建体能进入 至少一个植物细胞的内部。“稳定转化”意指引入植物的核苷酸构建体整合到植物的基因组 中并且能被其后代继承。当需要下调时，可以构建与ABA相关序列的信使RNA(mRNA)的至少一部分互补的 反义构建体。构建反义核苷酸与对应的mRNA杂交。可以对反义序列进行修饰，只要所述序 列与对应的mRNA杂交并且干扰对应mRNA的表达。这样，可以使用与对应的反义序列具有 70%,优选80%，更优选85%的序列相似性的反义构建体。此外，反义核苷酸的部分可以用 于破坏靶基因的表达。通常，可以使用至少50个核苷酸、100个核苷酸、200个核苷酸或更 长的序列。在有义方向上使用核苷酸序列抑制植物中基因表达的方法在本领域中也是已知 的。所述方法通常涉及用包含启动子的DNA构建体转化植物，所述启动子在植物中驱动表 达，可操作地连接到对应于内源基因(即ABA相关序列)转录物的核苷酸序列的至少一部 分。通常，该核苷酸序列与内源基因转录物的序列具有基本的序列同一性，优选高于约65% 的序列同一性，并且经常高于约85%的序列同一性，例如约95%的序列同一性。参见，美国 专利第5，283，184号和第5，034，323号，在此通过引用将两者并入。应当意识到，本发明可以使用ABA相关基因的片段和/或变体。因此本发明包括ABA相关核苷酸序列和由其编码的蛋白的片段和变体。“片段”意指部分的核苷酸序列或由 其编码的部分的氨基酸序列以及部分的蛋白。核苷酸序列的片段可以编码保留天然蛋白生 物活性的蛋白片段并因此发挥调节对ABA响应的作用。可选地，作为杂交探针有用的核苷 酸序列的片段通常不编码保留生物活性的片段蛋白。因此，核苷酸序列片段的变化范围可 以为至少约20个核苷酸、约50个核苷酸或约100个核苷酸，多达本发明的全长核苷酸序 列。“变体”意指基本上相似的序列。对于核苷酸序列，可以使用熟知的分子生物学技 术鉴定天然存在的变体，例如用下文列出的多聚酶链反应(PCR)和杂交技术。变异的核苷 酸序列还包括合成衍生的核苷酸序列，例如通过使用定点诱变生成的序列。通常，如本文其 他地方描述的序列比对程序所测定的，本发明具体核苷酸序列的变体与该具体核苷酸具有 至少约 40%、50%、60%、65%、70%，通常至少约 75%、80%、85%，经常至少约 90%、92%、 94%,95%,96%,97%或者甚至约98%、99%或更高的序列同一性。用于比较的序列比对的方法是本领域熟知的。因此，任何两条序列之间的同一 性百分比的测定可以使用数学算法实现。这些数学算法的非限制性实例是Myers and Miller (1988) CABIOS 4 :11_17 的算法；Smith，et al.，(1981) Adv. Appl. Math. 2 :482 的 局部同源性算法；Needleman and Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48 :443_453 的同源性比对 算法；Pearson and Lipman, (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85 2444-2448 的相似性搜索方 法(search-for-similarity-method) ；Karlin and Altschul, (1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :2264 的算法，如 Karlin and Altschul, (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877中所改良的。可以利用这些数学运算法则的计算机工具进行序列的比较以测定序列同一性。 这些工具包括但不限于PC/Gene程序(可获得自Intelligenetics，Mountain View, California)中的 CLUSTAL ；ALIGN 程序(版本 2. 0)和 Wisconsin Package ，版本 8 或版 本 10 (可获得自 Accelrys Inc. ,9685 Scranton Road, San Diego, California, USA)中 的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。可以使用默认参数执行使用这些程序的比对。 CLUSTAL 程序详细描述于 Higgins，et al.，(1989) CABIOS 5 151-153 ；Corpet, et al.， (1988)Nucleic Acids Res. 16 10881-90；Huang, et al.，(1992)CABIOS 8:155-165 和 Pearson, et al.，(1994)Meth. Mol. Biol. 24 :307_331 中。ALIGN 程序基于如上的 Myers and Miller, (1988)的运算法则。比较氨基酸序列时，PAM120权重残基表、12的空位长度 罚分(gap length penalty)和4的空位罚分(gap penalty)可以与ALIGN程序一起使 用。Altschul, et al.，(1990) J. Mol. Biol. 215 :403 的 BLAST 程序基于上文 Karlin and Altschul, (1990)的运算法则。BLAST核苷酸搜索可以用BLASTN程序进行，得分=100、字 符长度=12，以获得与编码本发明蛋白的核苷酸序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白搜索 可以用BLASTX程序进行，得分=50、字符长度=3，以获得与本发明蛋白或多肽同源的氨基 酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以使用Gapped BLAST (BLAST 2.0中)，其描 述于Atschul，et al. , (1997)Nucleic Acids Res. 25 :3389。可选地，PSI-BLAST(BLAST 2.0 中)可用于进行检测分子间远距离关系的迭代搜索(iterated search) 0参见Altschul， et al.，(1997)，同上。当使用BLAST时，可以使用Gapped BLAST、PSI-BLAST时，可使用各 自程序(例如用于核苷酸序列的BLASTN，用于蛋白的BLASTX)的默认参数。参见美国国家(National Center for Biotechnology Information)白勺_立占。 通过检查进行手动比对。除非另作说明，本文提供的序列同一性/相似性的值是指使用GAP版本10、使用以 下参数获得的值同一性百分比使用GAP权重为50并且长度权重为3 ；相似性百分比使用 GAP权重为12并且长度权重为4，或任何等同程序。“等同程序(equivalent program) ”意 指，对于所讨论的任何两条序列，生成如下比对的任何序列比较程序，该比对与优选的程序 生成的对应的比对相比，具有相同核苷酸或氨基酸残基匹配和相同的序列同一性百分比。GAP 使用 Needleham and Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48 :443_453 的算法寻找 两条完整序列的比对，该比对使匹配数目最大化并且使空位数目最小化。GAP考虑到所有 可能的比对和空位位置并且产生具有最大数目的匹配碱基和最少的空位的比对。其允许 在匹配碱基的单元中提供空位生成罚分(gap creation penalty)和空位延伸罚分(gap extension penalty)。对于其插入的每个空位，GAP必须利用匹配的空位生成罚分数目。如 果选择大于零的空位延伸罚分，那么对于插入的每个空位，GAP必须利用空位的长度乘以空 位延伸罚分。蛋白序列的Wisconsin Genetics Software Package的版本10中，默认的空 位生成罚分值和空位延伸值分别是8和2。对于核苷酸序列，默认的空位生成罚分是50，而 默认的空位延伸罚分是3。空位生成和空位延伸罚分可以表示为选自0-200的整数。因此， 例如空位生成和空位延伸罚分可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、 50、55、60、67 或更高。GAP是最佳比对家族的一个成员。该家族可以有很多成员，但是没有其他成员具有 更好的品质(quality)。GAP展示了四项对于比对的优点品质(Quality)、比率(Ratio)、 同一性(Identity)和相似性(Similarity)。品质为了比对序列的最大化的度量标准。比 率是品质除以更短的区段中的碱基数。同一性百分比(Percent Identity)是实际匹配的 符号的百分比。相似性百分比(Percent Similarity)是相似符号的百分比。忽略空位对 面的符号。当对于一对符号的评分矩阵值大于或等于0. 5即相似性阈值时，相似性才会评 分。Wisconsin Genetics Software Package 的版本 10 中使用的评分矩阵是 BL0SUM62 (参 见 Henikoff and Henikoff, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915)。“变体”蛋白意指通过以下而衍生于天然蛋白的蛋白天然蛋白的N末端和/或C 末端一个或多个氨基酸的缺失(所谓的截断)或添加；一个或多个氨基酸在天然蛋白中一 个或多个位点的缺失或添加；或者在天然蛋白中一个或多个位点处一个或多个氨基酸的取 代。这些变体可以来自于例如遗传多态性或人为操作。可以通过不同方式改变本发明的蛋白，包括氨基酸取代、缺失、截断和插入。这些 操作的方法本领域内通常是熟知的。诱变和核苷酸序列改变的方法是本领域熟知的。参 见，例如 Kunkel，(1985)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 488-492 ；Kunkel, et al.，(1987) Methods in Enzymo 1. 154 :367_382 ；美国专利第 4，873，192 号；Walker and Gaastra，eds. (1983)Techniques in Molecular Biology (分子生物学技术)(MacMillan Publishing Company,New York)以及其中引用的参考文献。关于不影响感兴趣的蛋白生物活性的合适 的氨基酸取代的指导，可以见于 Dayhoff，et al.，(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure (蛋白质序列与结构图谱)(Natl. Biomed. Res. Found.，Washington, D. C.(华盛 顿))的模型，在此通过引用并入。例如将一个氨基酸换为另一个具有相似性质的氨基酸的保守型取代是优选的。因此，本发明的基因和核苷酸序列同时包括天然存在的序列以及突变形式。同样， 本发明的蛋白同时包括天然存在的蛋白及其变种和修饰的形式。这些变体继续具有所需活 性。显然，对编码变体的DNA所作的突变必须不能将序列置于读码框之外并且优选不会生 成可以产生二级mRNA结构的互补区。参见，欧洲专利局专利申请公开第75，444号。预期本文所包括的蛋白序列的缺失、插入和取代不对蛋白的性质产生根本的改 变。然而，当在进行取代、缺失或插入之前很难预测其确切的效果时，本领域技术人员应当 理解到所述效果可以通过常规筛选检测来评价。变体核苷酸序列和蛋白还包括来源于诸如DNA改组(DNA shuffling)的诱变和重 组步骤的序列和蛋白。通过此类步骤，可以操作一个或多个不同的ABA相关编码序列，以生 成具有所需性质的新的ABA相关蛋白。这样，从包含具有基本的序列同一性并且可以进行 体外或体内同源重组的序列区的相关序列多核苷酸的群体，生成重组多核苷酸的文库。此 类DNA改组的策略是本领域已知的。参见，例如Stemmer，(1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 10747-10751 ；Stemmer, (1994)Nature 370 389-391 ；Crameri，et al.，(1997)Nature Biotech. 15 :436_438 ；Moore, et al.，(1997)J. Mol. Biol. 272 :336_347 ；Zhang, et al.， (1997)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 4504-4509 ；Crameri, et al. , (1988)Nature 391 288-291 ；以及美国专利第5，605，793号和第5，837，458号。本发明的ABA相关序列提供在用于在感兴趣的植物中表达的表达盒中。所述盒包 括可操作地连接于本发明的ABA相关序列的5’和3’调节序列。“可操作地连接”意指启动 子和第二序列之间的功能性连接，其中所述启动子序列启动和介导对应于所述第二序列的 DNA序列的转录。通常，可操作地连接表示连接的核酸序列是连续的，并且如果需要连接两 个蛋白编码区，其在相同的读码框内是连续的。所述盒还可以含有至少一个待共转化到生 物中的其他基因。可选地，所述其他基因可以在多重表达盒上提供。提供了具有很多限制性位点的表达盒，所述限制位点用于待处于调节区的转录调 节下的感兴趣的序列的插入。所述表达盒还可以含有选择标记基因。表达盒在转录的5’_3’方向上包括，转录和翻译起始区、本发明的DNA序列以及植 物中有功能的转录和翻译终止区。转录起始区(启动子)对于植物宿主可以是天然的或外 来的。另外，启动子可以是天然序列或可选地为合成的序列。“外来的(foreign)”意指被 引入转录起始区的天然植物中不会发现所述转录起始区。如本文使用的嵌合基因包含可操 作地连接到转录起始区的编码序列，所述转录起始区对于该编码序列是异源的。尽管优选 使用异源启动子表达序列，但也可以使用天然启动子序列。因此，改变了植物或植物细胞的 表型。终止区可以与转录起始区是天然的，可以与可操作地连接的感兴趣的DNA序列是 天然的或可以来自其他来源。方便的终止区可以从根癌农杆菌(A. tumefaciens)的Ti质粒 获得，例如章鱼肉碱合酶和胭脂碱(nonpaline)合酶终止区。还可参见，Guerineau，et al.， (1991)Mol. Gen. Genet. 262 141-144 ；Proudfoot, (1991)Cell 64 :671_674 ；Sanfaeon, et al.，(1991)Genes Dev. 5 :141_149 ；Mogen, et al.，(1990)Plant Cell 2 :1261_1272 ； Munroe,et al.，(1990)Gene 91 :151_158 ；Ballas,et al.，(1989)Nucleic Acids Res. 17 7891-7903 ；和 Joshi, et al.，(1987)Nucleic Acid Res. 15 :9627_9639。
合适的情况下，可以为了在转化的植物中增加表达而优化基因。也就是说，为了改 善表达，可以使用植物优选密码子合成所述基因。合成植物优选基因的方法在本领域中是 可以获得的。参见，例如美国专利第5，380，831号和第5，436，391号以及Murray，et al., (1989)Nucleic Acids Res. . 17 :477_498，在此通过引用并入。已知其他序列修饰能增强细胞宿主中基因表达。这包括编码假多聚腺苷酸信号、 外显子_内含子剪接位点信号、转座子样重复的序列以及不利于基因表达的其他此类充分 表征的序列的去除。序列的G-C含量可以调整至给定细胞宿主中的平均水平，这可通过参 考在所述宿主细胞中表达的已知基因来计算。可能的话，修饰序列以避免可提前预知的发 夹二级mRNA结构。表达盒还可以在表达盒构建体中含有5’前导序列(leader sequences)。此类 前导序列可以起作用增强翻译的作用。翻译前导区在本领域是已知的并包括细小核糖核 酸病毒前导区，例如EMCV前导区(脑心肌炎5’非编码区)(Elroy-Stein，et al.，(1989) PNAS USA 86:6126-6130)；马铃薯Y病毒属(potyvirus)前导区，例如TEV前导区(烟草 蚀纹病毒(Tobacco Etch Virus)) (Allison, et al.，(1986) ；MDMV 前导区(玉米矮花叶 病毒(Maize Dwarf Mosaic Virus)) ；Virology 154:9-20)以及人免疫球蛋白重链蛋白 (BiP)，(Mace jak, et al.，(1991) Nature 353 90-94)；来自苜蓿花叶病毒(alfalfa mosaic virus)的外壳蛋白 mRNA 的非翻译前导区(AMV RNA 4) (Jobling, et al.，(1987)Nature 325 622-625)；烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus leader)前导区(TMV) (Gallie, et al.，(1989) in Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, New York), pp. 237—256)；以
^^f^lif-^IK (maize chlorotic mottle virus leader) (MCMV) (Lommel, et al.，(1991)Virology81 382-385) 还可参见，Della—Cioppa，et al.，(1987)Plant Physiol. 84 :965_968。可以使用已知能增强翻译的其他方法，例如内含子等。在制备表达盒时，可操作各种DNA片段，以便将DNA序列提供于合适的方向，并且 视情况，提供于合适的读框内。最后，连接物(adapters)或接头(linkers)可以用于连接 DNA片段，或者可以涉及提供方便的限制位点、移除多余的DNA、移除限制位点等的其他操 作。为此，可以涉及体外诱变、引物修复、限制、退火、再取代，例如转换和颠换。转化方案以及将核苷酸序列引入植物的方案可根据靶向转化的植物或植物细 胞的类型的不同而不同，例如单子叶植物或双子叶植物。将核苷酸序列引入植物细胞以 及后续插入植物基因组的合适方法包括微注射(Crossway et al. (1986)Biotechniques 4:320-334)、电穿孑L (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606)、 农杆菌(Agrobacterium)介导的转化(Townsend, et al.，美国专利第5，981，840号)、 直接基因转移(Paszkowski et al. (1984)EMBO J. 3 :2717_2722)，和弹道粒子加速(参 见，例如，Sanford, et al.，美国专利第 4，945，050 号；Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment," in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture -Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips(Springer-Verlag, Berlin)；以及 McCabe et al. (1988)Biotechnology 6 923-926)。也可参见 Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22 :421_477 ；Sanford et al. (1987)Particulate Science and Technology 5:27_37(洋葱)；Christou et al. (1988)Plant Physiol. 87 671-674( ) ；McCabe et al. (1988)Bio/Technology 6 923-926 (大豆)；Finer and McMullen (1991) In VitroCell Dev. Biol. 27P 175-182 (大 豆)；Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96 :319_324 (大豆)；Datta et al. (1990) Biotechnology 8 736-740( /K fS ) ；Klein et al. (1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 4305-4309 (玉米)；Klein et al. (1988) Biotechnology 6 559-563(玉米)；Tomes, 美国专利第5, 240, 855号；Buising, et al.，美国专利第5, 322, 783号和第5，324，646 号；Tomes, et al. , (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment,，，in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture Fundamental Methods, ed. Gamborg(Sprinter-Verlag, Berlin)(玉 米)；Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91 :440_444 (玉米)；Fromm et al. (1990) Biotechnology 8 833-839 (玉米)；Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (London) 311 :763_764 ; Bowen, et al.，美国专利第 5，736，369 号(谷类)；Bytebier et al. (1987)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 :5345_5349(百合科(Liliaceae)) ；De Wet et al. (1985)in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, New York), pp.197-209(花粉)；Kaeppler et al. (1990)Plant Cell Reports 9 :415_418 和 Ka印pier et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84 :560_566 (噬菌体颈须介导的转化)； D ‘ Halluin et al. (1992) Plant Cell 4 1495-1505 (电穿孔)；Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12 :250_255 禾口 Christou and Ford(1995)Annals of Botany 75: 407-413 ( 7jCfS ) ；Osioda et al. (1996) Nature Biotechnology 14 745-750 (ilill^^ 杆菌的玉米)；以上均在此通过引用并入。可以按照常规方式使转化的细胞生长成植物。参见，例如McCormick et al. (1986)Plant Cell Reports 5 :81_84。然后可以种植这些植物，并且用相同的转化品系 或不同品系授粉，得到的植物具有鉴定出的所需表型特征的可接受的表达。可以种植两代 或更多代，以确保所需表型特征的表达稳定保持和遗传，然后收获种子以确保所需表型特 征的可靠表达已实现。本发明的某些实施方案包括任何植物种类的转化，包括但不限于单子叶植 物和双子叶植物。感兴趣的植物的实例包括但不限于，玉米(Zea mays)、芸苔属种类 (Brassica sp，例如欧洲油菜(B.napus)、芜青(B.rapa)、芥菜(B. juncea))，特别是那 些用作种子油来源的芸苔属种类、苜蓿(紫花苜蓿(Medicago sativa))、水稻(Oryza sativa)、漂麦(Secale cereale)、高梁(Sorghum bicolor、Sorghum vulgare)、稷(例如 珍珠稷(Pennisetum glaucum)、黄米(proso millet)(黍稷(Panicum miliaceum))、小 米(Setaria italica)、龙爪稷(Eleusine coracana))、向日葵(Helianthus annuus)、 红花(Carthamus tinctorius)、小麦(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、烟草 (Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、花生(Arachis hypogaea)、棉花(海 岛棉(Gossypium barbadense)、陆地棉(Gossypium hirsutum))、甘薯(Ipomoea batatus)、 木薯(Manihot esculenta)、咖啡(咖啡属种类(Coffea spp.))、椰子(Cocos nucifera)、 菠萝(Ananas comosus)、柑橘树(柑橘属禾中类(Citrus spp·))、可可(Theobroma cacao)、 荼(Camellia sinensis)、香蕉(色蕉属禾中类(Musa spp·))、鱼萼梨(Per sea americana)、 无花果(Ficus casica)、番石檔(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、木犀揽 (Olea europaea)、番木瓜(Carica papaya)、腰果(Anacardium occidentale)、澳大利亚坚胃(Macadamia integrifolia) (Prunus 已mygdalus)、舌甘胃(Beta vulgaris)、#胃(1ξ[" 蔗属种类(Saccharum spp.))、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。蔬菜包括番茄(Lycopersicon esculentum)、莴苣(例如莴苣(Lactuca sativa)) > ^- (Phaseolus vulgaris)、禾马 (Phaseolus limensis) > (Lathyrus spp·)、禾口黄瓜属(Cucumis)成员例如黄瓜(C. sativus)、哈密瓜(C. cantalupensis)禾口 甜瓜(C.melo)。观赏植物包括杜鹃花(杜鹃属种类(Rhododendron spp.))、八仙花 (MacrophyIla hydrangea)、芙蓉(Hibiscus rosasanensis)、攻瑰(蔷蔽属禾中类(Rosa spp·))、郁金香(郁金香属(Tulipa spp·))、水仙花(水仙属种类(Narcissus spp·))、 H ^p (Petunia hybrida)>β (Dianthus caryophyllus)、一 品红(Euphorbia pulcherrima)以及菊花。可以用于实践本发明的某些实施方案的针叶树包括，例如松树 例如火炬松(Pinus taeda)、沼泽松(Pinus elliotii)、西黄松(Pinus ponderosa)、黑 公(Pinus contorta)禾口 寸 公(Pinus radiata) ； Jft ^ (Pseudotsuga menziesii)； 力口 拿大铁杉(Tsuga canadensis)；苍白云杉(Picea glauca)；北美红杉(Sequoia sempervirens)；冷杉例如温哥华冷杉(Abies amabilis)和香脂冷杉(Abies balsamea)； 禾口雪松例如北美乔柏(Thuja plicata)禾口黄扁柏(Chamaecyparis nootkatensis)。优选 地，本发明的植物为农作物植物(例如玉米、苜蓿、向日葵、芸苔属、大豆、棉花、红花、花生、 高粱、小麦、稷、烟草等)，更优选地玉米和大豆植物，还更优选地玉米植物。特别感兴趣的植物包括提供感兴趣的种子的谷类植物，含油种子植物和豆科植 物。感兴趣的种子包括谷类种子，例如玉米、小麦、大麦、水稻、高粱、黑麦等。含油种子植物 包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔属、玉米、苜蓿、棕榈、椰子等。豆科植物包括豆和豌豆。 豆包括瓜尔豆、槐豆(locust bean)、胡芦巴、大豆、青刀豆(garden beans)、豇豆、绿豆、利 马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等。以举例说明而非限制的方式，提供下列实施例。实验转基因植物的转化和再生实施例1 转基因玉米植物的基因枪法转化和再生来自温室供体植物的未成熟的玉米胚用含有玉米ABIl序列或基于拟南芥abil G180突变体的玉米abil突变体的序列的质粒加上含有选择标记基因PAT(Wohlleben et al. (1988)Gene 70:25-37)的质粒轰击，所述玉米abil突变体的序列可操作地连接于早期 子粒/胚启动子，所述选择标记基因PAT赋予除草剂双丙氨膦抗性。转化按照以下进行，所 有培养基配方见下文。靶组织的制备玉米穗在30% Clorox 漂白剂外加0.5%微去垢剂中表面灭菌20分钟，然后用 灭菌水漂洗2次。切除未成熟的胚，将其按胚轴一侧向下放置(盾片一侧向上)，每板25个 胚，在560Y培养基上4小时，然后在2. 5cm的靶区域内排列好，用于准备轰击。DNA的制备制备包含可操作地连接到早期子粒/胚启动子上的突变玉米abil序列的质粒载 体。该质粒DNA加上含有PAT选择标记的质粒DNA通过使用CaCl2沉淀法沉淀到1. 1 μ M(平 均直径)的钨珠上，CaCl2沉淀步骤如下
100 μ 1制备的钨颗粒的水溶液10 μ 1 (1 μ g)溶于 Tris EDTA 缓冲液中(总共 Iyg)的 DNA100 μ 1 的 2· 5Μ CaCl210 μ 1 的 0. IM 亚精胺将每种试剂依次添加到钨颗粒悬液中，同时保持在多管漩涡器上。将最终混合物 进行简单的超声波处理，允许在持续涡漩下孵育10分钟。沉淀期后，将管子简单离心，移 除液体，用500ml 100%的乙醇洗涤，离心30秒。再次移除液体，向最终的钨颗粒珠中添加 105 μ 1100%的乙醇。对于粒子枪轰击，将钨/DNA颗粒进行简单的超声波处理，取10 μ 1点 样于每个大载体(macrocarrier)的中央，轰击前，允许干燥约2分钟。粒子枪处理在粒子枪#HE34-1或#HE34_2对样品板进行4级轰击。所有的样品受到一次650 PSI的轰击，从每管制备的颗粒/DNA，总共取10份等分试样。后续处理轰击后，将胚在560Y培养基上保持2天，然后转移到含有3mg/l双丙氨膦的560R 选择培养基，每2周进行传代培养。大约选择10周后，将抗选择的愈合组织克隆转移到288J 培养基，开始植物再生。体细胞胚成熟后(2-4周)，将发育良好的体细胞胚转移到培养基 中发芽，并转移到光照培养室。约7-10天后，将发育的小植物转移到管子内272V无激素培 养基7-10天，直到小植物彻底扎根。然后将植物转移到含有盆栽土的浅箱(flat，相当于 2.5〃罐)中的插入物(insert)，在生长室中生长1周，后续在温室中再生长1-2周，然后转 移到classic 600罐中(1. 6加仑)，并生长至成熟。监控植物并评分。轰击用培养基和培养用培养基轰击用培养基(560Y)包含4. Og/1 N6 基础盐(SIGMA C-1416)、1· Oml/1 Eriksson ' s 维生素混合物(1000 X SIGMA-1511)、0. 5mg/l 盐酸硫胺、120. Og/Ι 蔗糖、
1.Omg/1 2，4-D和2.88g/l L-脯氨酸(用KOH调节到ρΗ5· 8后用D-I H2O补足体积)；
2.Og/1 Gelrite (用D-I H2O补足体积后加入)；和8. 5mg/l硝酸银(将培养基灭菌并 冷却至室温后加入)。选择培养基(560R)包含4. Og/1 N6基础盐(SIGMA C-1416) U. Oml/ 1 Eriksson' s 维生素混合物(1000XSIGMA-1511)、0· 5mg/l 盐酸硫胺素、30. Og/1 蔗糖和 2. Omg/1 2，4-D (用 KOH 调节到 ρΗ5· 8 后用 D-I H2O 补足体积)；3. Og/lGelrite (用 D-I H2O补足体积后加入)；以及0. 85mg/l硝酸银和3. Omg/1双丙氨膦(两者均是在将培养基 灭菌并冷却至室温后加入)。植物再生培养基(288J)包含4. 3g/l MS 盐(GIBC0 11117-074)、5. Oml/1 MS 维生 素储备液(O. IOOg烟酸、0. 02g/l盐酸硫胺素、0. 10g/l盐酸吡哆辛和0. 40g/l甘氨酸，用精 制的 D-I H2O 补足体积)(Murashige 和 Skoog (1962) Physiol. Plant. 15 :473)、100mg/l 肌 醇、0. 3mg/l玉米素、60g/l蔗糖和1. 0ml/l的0. ImM脱落酸(调节到ρΗ5· 6后用精制的D-I H2O补足体积)；3. 0g/l Gelrite (用D-I H2O补足体积后加入)；和1. 0mg/l吲哚乙酸 和3. 0mg/l双丙氨膦(将培养基灭菌并冷却至60°C后加入)。无激素培养基(272V)包含 4. 3g/l MS 盐(GIBC0 11117-074)、5. 0ml/l MS 维生素储备液(0. IOOg 烟酸、0. 02g/l 盐酸 硫胺、0. 10g/l盐酸吡哆辛和0. 40g/l甘氨酸(用精制的D-I H2O补足体积)、0. lg/Ι肌醇 和40. Og/Ι蔗糖(调节到ρΗ5· 6后用精制的D-I H2O补足体积)；和6g/lBaCtoTM琼脂(用精制的D-I H2O补足体积后加入)，灭菌并冷却至60°C。实施例2 农杆菌介导的玉米的转化用可操作地连接于早期子粒/胚启动子的突变玉米abil序列进行的农杆菌介 导的玉米的转化，优选地使用Zhao的方法(美国专利第5，981，840号和PCT专利公开 W098/32326，以上内容在此通过引用并入)。简单地说，从玉米中分离未成熟的胚，并使胚 与农杆菌的悬液接触，其中该细菌能将可操作地连接于早期子粒/胚启动子的abil序列转 移到至少一个未成熟胚中的至少一个细胞内(步骤1:感染步骤)。在此步骤中，为了开始 接种，将未成熟胚优选地浸泡在农杆菌悬液中。将胚与农杆菌共培养一段时间(步骤2:共 培养步骤)。感染步骤后，将未成熟的胚培养在固体培养基上。该共培养期后，考虑可选的 “休眠(resting)”步骤。在该休眠步骤中，在存在至少一种已知抑制农杆菌生长的抗生素， 而无需加入植物转化体的选择剂的情况下孵育胚(步骤3 休眠步骤)。将未成熟胚培养在 有抗生素但没有选择剂的固体培养基上，用于除去农杆菌属和给予感染细胞休眠期。接下 来，将接种的胚培养在含有选择剂的培养基上，恢复生长的转化的愈合组织(步骤4 选择 步骤)。将未成熟胚培养在含有选择剂的固体培养基上，从而导致转化细胞的选择性生长。 然后将愈合组织再生为植物(步骤5 再生步骤)，优选地将生长在选择性培养基上的愈合 组织培养在固体培养基上，来再生植物。实施例3 大豆胚转化如下文，大豆胚用含有可操作地连接于早期胚/子粒启动子的突变玉米abil核苷 酸序列的质粒轰击。为诱导体细胞胚，从大豆栽培品种A2872的表面灭菌的未成熟的种子 中分离的长度为3-5mm的子叶在光照或无光条件下、26°C、适合的琼脂培养基上培养6-10 周。然后切除产生次级胚的体细胞胚并将其置于适合的液体培养基中。反复选择增殖为早 期的球形期(globular-staged)的胚的体细胞胚的簇后，悬液按照下文所述保持。26°C下，大豆胚发生悬浮培养物保持在150rpm的旋转振荡器上的35ml液体培养 基中，伴随荧光灯的白天/夜晚计划为16小时8小时。每2周，通过将大约35mg组织接 种到35ml液体培养基中，对培养物进行传代培养。然后，大豆胚发生悬浮培养物通过粒子枪轰击的方法进行转化(Klein，et al.， (1987)Nature(London)327 :70-13，美国专利第 4，945，050 号)。DuPont Biolistic PDS 1000/HE仪器(氮气改进型)可以用于这些转化。可以用于促进大豆转化的选择标记基因是转基因，其组成为来自花椰菜花叶病 毒(Cauliflower Mosaic Virus)的 35S 启动子(Odell，et al.，(1985)Nature 313 810-812)、来自质粒pJR225的潮霉素磷酸转移酶基因(来自大肠杆菌(E. coli) ；Gritz, et al.，(1983) Gene 25 179-188)以及来自根癌农杆菌Ti质粒的T-DNA的胭脂碱合酶基因的 3’区。包含可操作地连接到早期子粒/胚启动子的突变abil核苷酸序列的表达盒可以作 为限制性片段分离。然后，可以将该片段插入携带标记基因的载体的独特的限制性位点。向50 μ 1 的 60mg/ml 1 μ m 金颗粒悬液中(依次)加入5 μ 1 DNA(ly g/μ 1), 20 μ 1亚精胺(0. 1Μ)和50 μ 1 CaCl2 (2. 5Μ)。然后将颗粒制剂搅动3分钟，在微型离心机中 离心10秒钟并移除上清液。然后将DNA包被的颗粒在400 μ 1 70%乙醇中洗涤一次并重悬 浮于40μ1的无水乙醇中。可以将DNA/颗粒悬液进行3次超声波处理，每次一秒。然后， 将5μ1 DNA包被的金颗粒装载到每个大载体(macro carrier)盘上。
将约300-400mg的两周龄悬浮培养物置于空的60X 15mm皮氏培养皿中，并且使用 吸液管从组织中移除残留液体。对于每次转化实验，通常轰击约5-10板的组织。膜破坏压 力设定在llOOpsi，并且将小室抽成28英寸汞柱的真空。将组织距离保持屏约3. 5英寸放 置，并轰击三次。轰击后，组织可以对半分开并放回液体，按照上述培养。轰击后5-7天，液体培养基可以更换为新鲜培养基，并且轰击后11-12天更换为含 有50mg/ml潮霉素的新鲜培养基。该选择培养基可以每周更新。轰击后7至8周，可以观 察到绿色的转化组织从未转化的、坏死的胚发生簇中生长。移除分离的绿色组织，并接种于 单独的瓶中以生成新的、无性繁殖的、转化的胚发生悬浮培养物。每个新的系可以作为独立 的转化事件来对待。然后将这些悬液可以进行传代培养并且保持为未成熟胚的簇或通过单 独体细胞胚的成熟和发芽再生为完整的植物。实施例4 向日葵分裂组织转化如下文，用含有可操作地连接到早期子粒/胚启动子的突变玉米abil序列的 表达盒转化向日葵分生组织(还可参见，欧洲专利号EP0486233，在此通过引用并入，和 Malone-Schoneberg, et al. (1994)Plant Science 103:199—207)。成熟的向日葵种子 (Helianthus annuus L.)用单个小麦头脱壳机(single wheat-head thresher)去壳。将 种子在20% Clorox 漂白液(bleach solution)中表面灭菌30分钟，该漂白液每50ml添 加2滴Tween 20。将种子用灭菌蒸馏水漂洗两次。劈开胚轴的外植体的制备是按照 Schrammeijer，et al. (Schrammei jer, et al.， (1990) Plant Cell R印.9 :55_60)中所述步骤的修改版。表面灭菌步骤后，将种子在 蒸馏水中吸涨60分钟。然后折断每一外植体的子叶，在胚轴的平面上产生清洁的折断 面。切除根尖后，外植体在初叶间纵向一分为二。切面向上，将两个半体置于由以下组 成的 GBA 培养基上Murashige 和 Skoog 矿物元素(Murashige，et al.，(1962) Physiol. Plant. 15 :473_497)、Shepard' s 维生素添力口物(Shepard (1980) in Emergent Techniques for the Genetic Improvement of Crops(University of Minnesota Press, St. Paul, Minnesota)、40mg/l 吲哚-3-乙酸(IAA)、0· lmg/1 赤霉酸(GA3)、pH 5.6 以及 8g/l 植物凝 月交(Invitrogen, Carlsbad, CA)。农杆菌属处理前，外植体经受微粒轰击(microprojectile bombardment) (Bidney, et al.，(1992)Plant Mol. Biol. 18 :301_313)。30-40 个外植体在用于此次处理 的60 X 20mm板的中心放置成一圈。将约4. 7mg 1. 8mm钨微粒重悬于25ml灭菌的TE缓冲液 中(IOmM Tris HClUmM EDTA，pH 9. 0)，并且每次轰击使用1. 5ml等分试样。在PDS1000 粒子加速装置中，每个板通过放置在样品上方2cm的150mmnytex屏轰击两次。非致瘤(disarmed)根癌农杆菌菌株EHA105用于所有的转化实验中。按照 Holsters, et al.，(1978)Mol. Gen. Genet. 163 :181_187 所述，通过冻融将包含表达盒的双 元质粒载体引入农杆菌菌株EHA105，所述表达盒含有可操作地连接于早期子粒/胚启动子 的ABI3基因。该质粒还包含卡那霉素选择标记基因(即nptll)。将用于植物转化实验的 细菌在具有细菌菌株和双元质粒维持所需的合适的抗生素的液体YEP培养基(10gm/l酵母 提取物、10gm/l Bacto 蛋白胨和5gm/l NaCl,pH 7. 0)中生长过夜(28°C并且100RPM连续 摇动)。当悬液达到约0. 4-0. 8的OD6tltl时，使用该悬液。将农杆菌细胞成团，并在接种培养 基中重悬为0. 5的最终0D_，所述接种培养基由12. 5mM MES ρΗ5· 7、lgm/l NH4Cl和0. 3gm/1 MgSO4 组成。将刚轰击后的外植体置于农杆菌悬液中、混合并且静置30分钟。然后，外植体转 移到GBA培养基并且切面向下于26°C、一天18小时共培养。共培养三天后，外植体转移到 补充了 250mg/l头孢噻肟和50mg/l硫酸卡那霉素的374B (缺乏生长调节剂和1 %的降低的 蔗糖水平的GBA培养基)。在选择时，将外植体培养2-5周，然后转移到新鲜的缺乏卡那霉 素的374B培养基上继续发育1-2周。将具有分化的抗生素抗性生长区的外植体转移到含 有250mg/l头孢噻肟的GBA培养基进行第二次3天的植物激素处理，所述生长区未产生适 合于切除的薄片(sheets)。通过ELISA，检测来自绿色的抗卡那霉素的苗(shoots)的叶样 品是否存在NPTII，以及通过检测植物对ABA的响应的调节，检测是否存在转基因表达。将NPTII阳性苗嫁接到Pioneer· 杂种6440体外生长的向日葵幼苗根茎。使表面 灭菌的种子在48-0培养基(半强度Murashige和Skoog盐类、0. 5%蔗糖、0. 3% Gelrite 、pH5.6)中发芽并且在针对外植体培养所述的条件下生长。移除幼苗的上面部分，在下胚 轴中制造Icm的垂直切片，并且将转化的苗插入到切口中。整个区域用ParafiInn 包裹来 保护苗。体外培养后一周，可以将嫁接植物转移到土壤中。将土壤中的嫁接体保持在高湿 度条件下，然后缓慢的适应温室环境。通过例如叶提取物的NPTII ELISA鉴定温室中成熟 的TO植物(亲本代)的转化的部分，同时通过检测植物对ABA的响应的调节，鉴定收获于 NPTII阳性Ttl植物的转基因种子。实施例5 =ZmABIl的克隆和基因表征最初通过使用已知的拟南芥和水稻ABIl编码序列，经由电脑模拟(in silico)搜 索专利的玉米EST和GSS数据库，鉴定推定代表玉米中ABIl基因的序列。基于蛋白水平的 与参考序列的同源性以及对候选序列来源的文库的考虑，选择候选ESTs。根据候选EST序列，生成引物并用于筛选专利的玉米BAC文库。鉴定出的超级池 (Super-pools)用合适的引物进一步筛选，以鉴定包含ESTs的具体BAC克隆。在每种情况下，使用以下循环参数进行降落PCR (touchdown PCR) (GeneAmp PCR System 9700，Applied Biosystems) :94°C持续 3min (1 个循环)，94°C持续 lmin，55°C持续 Imin和72°C持续Imin 30s, (35个循环)，72°C持续7min，并终止于4°C。使用Pfu Ultra Hotstart DNA聚合酶(Stratagene)，因为其非常低的平均错误率(每500-bp扩增的片段 小于0.5% )。从BAC克隆中分离玉米插入DNA，并且将其消化用于使用候选EST克隆作为探针进 行 DNA 印迹验证。将 BAC 片段亚克隆到 pBluescript 中(Stratagene Inc.，La Jolla, CA)。使白色菌落在LB培养基中生长，并使用斑点印迹法将其转移到膜上。变性后，用候选 EST克隆探查膜。鉴定阳性克隆并测序。实施例6 玉米ABI候选基因的表征为了进一步表征分离的玉米ABIl基因，对Lynx MPSS mRNA进行概述(参见 Brenner et al. (2000)Nature Biotechnology 18 630-634 ；Brenner et al. (2000)PNAS 97 1665-1670)。结果总结在表1中。
权利要求
1.调节植物对脱落酸(ABA)的响应的方法，所述方法包括将包含可操作地连接于异源启动子的ZmABIl或ZmABIl突变核酸的DNA构建体引入所 述植物，所述异源启动子驱动发育的种子组织中的表达。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述调节包括降低对ABA的响应。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述引入是通过育种。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述引入是通过转化。
5.降低胁迫对发育的植物种子的不利影响的方法，所述方法包括将包含可操作地连接到异源早期子粒/胚启动子的ZmABIl或ZmABIl突变核酸的DNA 构建体引入植物，并且表达所述ABA相关序列，由此降低胁迫的不利影响。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述调节对ABA的响应是降低对ABA的响应。
7.植物细胞，具有稳定引入的DNA构建体、可操作地连接于异源早期子粒/胚启动子的 ZmABIl或ZmABIl突变核酸。
8.如权利要求7所述的植物细胞，其中所述调节降低对ABA的响应。
9.如权利要求7所述的植物细胞，其中所述DNA构建体稳定地整合到所述植物的基因 组中。
10.包含选自以下的核苷酸序列的分离的多核苷酸(a)SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列；(b)编码SEQID NO :4所示的氨基酸序列的核苷酸序列；(c)与SEQID NO :3具有至少95%同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码调 节ABA识别或信号传送的多肽。
11.包含选自以下的核苷酸序列的分离的多核苷酸(a)SEQ ID NO 8所示的核苷酸序列；(b)编码SEQID NO 10所示的氨基酸序列的核苷酸序列；(c)与SEQID NO :8具有至少95%同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码调 节ABA识别或信号传送的多肽。
12.SEQ ID NO 11的分离的多核苷酸。
13.编码SEQID NO 12的分离的多核苷酸。
14.包含权利要求10所述的多核苷酸的DNA构建体，其中所述多核苷酸可操作地连接 于驱动宿主细胞中表达的启动子。
15.包含权利要求11所述的多核苷酸的DNA构建体，其中所述多核苷酸可操作地连接 于驱动宿主细胞中表达的启动子。
16.细胞，具有稳定并入其基因组的至少一个包含权利要求10所述的多核苷酸的DNA 构建体，其中所述多核苷酸可操作地连接于驱动所述细胞中表达的异源启动子。
17.细胞，具有稳定并入其基因组的至少一个包含权利要求11所述的多核苷酸的DNA 构建体，其中所述多核苷酸可操作地连接于驱动所述细胞中表达的异源启动子。
全文摘要
提供了在发育的种子中调节脱落酸(ABA)识别和信号转导的组合物和方法。该方法和组合物在增加植物产量中是有用的，特别是在非生物胁迫下。组合物包含已知影响ABA敏感性的基因构建体，特别是ABA生物合成突变体及其片段和变体。
文档编号C07K14/415GK101998994SQ200980112945
公开日2011年3月30日 申请日期2009年2月13日 优先权日2008年2月13日
发明者尼古拉斯·J·贝特, 牛西平 申请人:先锋国际良种公司