专利名称：玉米ZmCIPK12基因及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于转基因植物领域，本发明涉及一种与类似钙调磷酸酶B亚基的蛋白(calcineurin B-Iike proteins, CBLs)互作的蛋白激酶(CIPK)的制备方法,本发明还涉及类似I丐调磷酸酶B亚基的蛋白(calcineurin B-Iike proteins, CBLs)互作的蛋白激酶(CIPK)基因在转基因植物中的应用。
背景技术：
Ca2+是植物生长的必需元素之一，不同的外界刺激信号都可以引起细胞内Ca2+浓度发生瞬间、持续或振荡变化。这些刺激包括非生物和生物刺激，非生物刺激有光、高温、低温、氧化胁迫等；生物刺激有激素ABA和赤霉素、病原激发子等。越来越多的研究表明，在非 生物逆境胁迫信号的转导中，钙离子是最重要的第二信使之一。首先，植物受到干旱、冷害、盐胁迫时，胞内Ca2+浓度会迅速升高；其次，Ca2+浓度升高能够调控许多胁迫诱导基因的表达；其三，胁迫反应基因的启动子的激活同样需要Ca2+浓度的增加。因此，现在普遍认为Ca2+作为第二信使将胁迫信号传输到调控通路的下游，Ca2+信使的传递是通过钙结合蛋白介导的。目前,在植物中已鉴定出许多Ca2+结合蛋白(calcium sensors)。主要有三类隹丐调素(calmodulin, CaM)及I丐调素相关蛋白(CaM-related proteins) 丐依赖蛋白激酶(calcium-dependent protein kinases, CDPK);类似于动物I丐调憐酸酶B亚基的蛋白(calcineurin B-Iike proteins, CBLs)。第一类,I丐调素及I丐调素相关蛋白是大家最为熟知的一类Ca2+结合蛋白，它含有4个能够直接结合Ca2+的典型的EF-hand结构域。钙调素自身并没有酶活性，只有其活化后进一步作用于它的目标蛋白，才能实现信号的传递。钙调素作用的目标蛋白包括蛋白激酶、转运子、结构蛋白等。第二类，CDPK是一类既含有类似于CaM结合Ca2+的结构域，同时也含有激酶结构域的蛋白激酶，因此，它的独特性就在于它可以同时作为Ca2+的感应分子和效应分子。第三类Ca2+结合蛋白-CBL，是最近几年才发现的，目前只发现存在于高等植物中。它和CaM —样，只含有Ca2+的结合域，不含有激酶区。CBL与CaM不同的是，它调控的是一类特殊的蛋白激酶，称为CBL互作蛋白激酶(CBL-interactingprotein kinases, CIPKs)。CIPK在N端含有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶区,并通过其特有的C末端区域(C-terminal region)与CBL互作。通过对已知的基因组数据(包括EST)的扫描分析发现，CBL和CIPK只存在于植物中，说明他们可能是植物所特有的一类基因家族，可能出现于植物的早期进化中。由于CIPK基因是近几年才发现的，所以对于CIPK基因的研究，目前还是非常有限的。虽然到目前为止，通过基因组数据的分析已经发现在拟南芥上有10个CBL基因，25个CIPK基因，在水稻上有10个CBL基因，30个CIPK基因，但也只有个别的基因的功能得以研究，对于不同CBL，CIPK基因所调控的不同的信号途径也仅限于初步的了解。美国朱健康教授研究组利用在盐胁迫下筛选拟南芥突变体的方法，鉴定了几个SOS (Salt OverlySensitive)基因，其中S0S2就是一个CIPK基因(也称为AtCIPK24)，而S0S3就是一个CBL基因(也称为AtCBL4)。S0S2和S0S3突变体对盐胁迫极为敏感，说明S0S2和S0S3基因在拟南芥对盐胁迫的抗性中起重要作用。当植物受到高盐胁迫时，引起胞内Ca2+浓度升高，S0S3首先感受到Ca2+所传导的胁迫信号，然后特异性地激活S0S2，S0S2进一步作用于Na+/H+反转运子(即S0S1)，SOSl将胞内多余的Na+转运到胞外，达到抵抗Na+对植物细胞的毒害作用。这一调控通路是在目前的抗逆研究领域中研究的比较清楚的调控途径。美国LuanSheng教授研究组在1999年克隆了拟南芥AtCBLl基因，并通过酵母双杂的方法，克隆了与AtCBLl互作的AtCIPKl基因。2003年他们对拟南芥的CIPK家族成员之一 AtCIPK3基因的功能进行了研究，发现CIPK3基因在3-7天的幼苗期有较高的表达，在成株期表达量很低，有趣的是，AtCIPK3基因在ΑΒΑ、冷害、高盐、干旱、机械伤害等诱导下高水平的表达。但是AtCIPK3的突变体在各种逆境的胁迫下，并没有明显的表型的变化。然而，在AtCIPK3的突变体上，对许多明显受ABA和各种胁迫调控的基因的表达的研究却发现，一些信号调控途径已经发生改变，但是干旱诱导的基因的表达并没有受到影响，说明AtCIPK3是有选择地来调控植物在ABA和各种胁迫下的调控途径。对于AtCIPK3继续研究所得的另一个重要发现是，AtCIPK3可能是在各种胁迫下依赖ABA调控途径和不依赖ABA调控途径的调节的关键枢纽(cross-talk node)。Chikano等(2001)研究发现另外一个拟南芥CIPK家族成员
之一 AtSR2(即AtCIPK14)参与到糖的调控途径中，AtCIPKH的突变体对葡萄糖(Glc)非常敏感，但是但是对各种渗透胁迫却没有任何反应，暗示着AtCIPKH可能特异性地参与在糖的调控体系中。因此，目前对于植物CIPK基因的研究正是一个方兴未艾的领域，仅有的一些研究结果只是对这一领域的初步探索，这方面的研究工作基本上是在模式植物拟南芥上进行的。对于重要作物(如水稻、玉米、小麦等)的此类基因的研究还鲜有报道，特别是有关玉米CIPK基因的功能研究尚未见应用。
发明内容
本发明的内容为提供一个玉米ZmCIPK12的基因序列，利用ZmCIPK序列信息扩增该基因，并构建过表达载体转化模式植物拟南芥，获得的转基因植株在150mM NaCL、350mM甘露醇上表现为对渗透胁迫和盐胁迫的抗性。本发明的技术方案如下玉米ZmCIPK12基因，具有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；该基因编码区全长1512个碱基，基因中的激酶结构域为第321个至第597个共276个碱基(图I)，该蛋白由504个氨基酸残基组成。利用该序列信息，扩增该基因，构建克隆载体以及植物表达载体，并转化拟南芥，转基因植株在NaCL及甘露醇培养基上培养，结果表明转基因植株表现为对渗透胁迫和盐胁迫的抗性，说明CIPK12编码的蛋白能够调控植物抗逆过程。本发明中ZmCIPK12通过基因调控来参与植物抗逆过程成为可能对于培育高产的转基因农作物具有重要意义。
图I :为ZmCIPK12核苷酸序列与氨基酸序列，ATG为起始密码子，*为终止符号。图2 :植物表达载体示意图；35S PROM为35S启动子，NOS term为NOS终止子，NPTII为编码卡那霉素抗性的标记筛选基因。图3 ZmCIPK12转基因株系目的基因的PCR检测；M =Marker ; I :正对照(以ZmCIPK12表达载体为PCR模板)；2 :负对照(以野生型拟南芥DNA为PCR模板)；3_9 ZmCIPK12不同转基因株系目的基因扩增结果图4 :转基因拟南芥与野生型植株在150mM NaCl的生长情况比较；转35S :ZmCIPK12基因拟南芥种子点播在含有150mM NaCl的MS培养基上，4°C春化3d后，置于22°C培养，IOd后观察生长状况转基因株系在150mM NaCl的平板上生长明显受到抑制，部分幼苗出现玻璃化情况，但转基因株系12-7、12-19长势明显优于WT，NaCl对幼苗根长也有明显抑制作用。图5 :转基因拟南芥与野生型植株在300mM甘露醇上的生长情况比较；转35S ZmCIPK12基因拟南芥种子点播在含有300mM甘露醇的MS培养基上，4°C春化3d后，置于22°C培养，IOd后观察生长状况，从图可知，ZmCIPK12-19、12-23两个株系根长明显比WT长， 叶片变化不是很大，说明转基因株系对甘露醇有明显抗性。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。实施例I :含有CIPK蛋白激酶基因的表达载体的构建I、以本发明中 ZmCIPK12 的 cDNA 序列，设计引物 C12-F ATGGACGCTACCCCGCCGTC,C12-R CTAATCAGTATCAGAAGGTAT,以玉米cDNA为模板，扩增ZmCIPK12基因序列，扩增体系
为
模板IOOng
C12F (IOuM)0.5 uL
C12-R (IOuM)0.5 uL
dNTP(lOmM)0.5 uL
聚合酶5 U
聚合酶缓冲液(IOX)2 uL
ddw补足至20 uL94°C变性3分钟；94°C变性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸I分30秒，35个循环；72°C延伸7分钟。PCR产物低温保藏备用。 2、用普通琼脂糖凝胶回收试剂盒，回收PCR产物，将回收的PCR产物与T载体连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α，挑取转化阳性的克隆提取质粒送测序，经过测序确定正确的克隆用于后续克隆及酶切。3、将ρΒΙ121质粒用BamH I和Sac I进行双酶切，并用琼脂糖凝胶试剂盒回收目的片段，同时用BamH I和Sac I进行酶切连接在T载体的CIPK12片段切，并回收，将回收的CIPK12片段与ρΒΙ121载体片段连接，然后后转化DH5 α感受态细胞，获得重组克隆，结果酶切和PCR检测后将正确的克隆命名为PBI121-CIPK12。实施例2 :含有CIPK12蛋白激酶基因的转化与筛选I、构建好的ZmCIPK12表达载体pBI121_CIPK12转入农杆菌GV3101。2、用沾花浸染(floral dipping)的方法转化拟南芥野生型。3、将转化后得到的Ttl代种子春化3天，然后直接播种到营养土中生长，正常生长约两周后，用O. 5%。的卡那霉素喷洒Ttl代拟南芥筛选转化植株。4、由于所用的表达载体pBI121-CIPK12带有抗卡那霉素的NPTII基因，它在转化时能随目的基因一起转入植物体，所以在喷施卡那霉素后大部分未转化植株死亡，而转化植株仍然能够正常生长。转化植株按照不同株系分别收获T1代种子。5、收获各转基因株系T2代种子后，用O. 5%的NaClO对种子进行消毒处理。然后 点种于含有O. 5%。的卡那霉素的MS培养基平板中(每个转基因株系需要约40粒种子)，以野生型为负对照。6、春化三天后置于22度光照培养箱中生长，一周后观察幼苗生长情况。野生型在含O. 5%。的卡那霉素的MS培养基中无法存活；T2代杂合体转基因株系由于在产生子代的过程中会发生基因分离与自由组合，因此会有一部分无卡那霉素抗性的种子出现；只有T2代为纯合体转基因株系的种子能全部在含卡那霉素的MS培养基中存活。实施例3 :含有CIPK蛋白激酶基因的转基因植株核酸PCR分析I、以提取的阳性植株的总DNA为模板，用ZmCIPK12基因引物进行PCR扩增，阳性植株能够扩增出I. 5kb和的条带，而假阳性植株则无PCR产物。野生型植株不能扩增出目的条带(图3)。2、收获各转基因株系T2代种子后，用O. 5%的NaClO对种子进行消毒处理。然后点种于含有O. 5%。的卡那霉素的MS培养基平板中(每个转基因株系需要约40粒种子)，以野生型为负对照。3、春化三天后置于22°C光照培养箱中生长，一周后观察幼苗生长情况。野生型在含O. 5%。的卡那霉素的MS培养基中无法存活。4、T2代杂合体转基因株系由于在产生子代的过程中会发生基因分离与自由组合，因此会有一部分无卡那霉素抗性的种子出现；只有T2代为纯合体转基因株系的种子能全部在含卡那霉素的MS培养基中存活。实施例4 :含有CIPK蛋白激酶基因的转基因植株与野生型植株抗逆性比较将ZmCIPK12转基因株系在含有150mM的NaCl、300mM的甘露醇的MS平板上的表型进行了分析。从结果(图4、图5)中可以看出，相对野生型而言，野生型在高盐和甘露醇胁迫下叶子萎蔫发黄程度严重，而两者在正常MS培养基中表型无明显差别。应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
权利要求
1.玉米ZmCIPK12基因，具有SEQID NO : I所示的核苷酸序列。
2.包含权利要求I所述的玉米ZmCIPK12基因的细胞、载体在用于产生耐旱、耐盐碱的植物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一个与拟南芥同源的玉米ZmCIPK12基因及其克隆方法和应用。该基因编码区全长1512个碱基，基因中的激酶结构域为第321个至第597个共276个碱基，该蛋白由504个氨基酸残基组成。利用该序列信息，扩增该基因，构建克隆载体以及植物表达载体，并转化拟南芥，转基因植株在NaCL及甘露醇培养基上培养，结果表明转基因植株表现为对渗透胁迫和盐胁迫的抗性，说明CIPK12编码的蛋白能够调控植物抗逆过程。本发明中ZmCIPK12通过基因调控来参与植物抗逆过程成为可能对于培育高产的转基因农作物具有重要意义。
文档编号C12N1/21GK102943080SQ20121041001
公开日2013年2月27日 申请日期2012年10月17日 优先权日2012年10月17日
发明者陈勋基, 黄全生, 陈果, 李建平, 足母热木, 邵琳 申请人:新疆农业科学院核技术生物技术研究所