专利名称：一种黄瓜疫霉菌lamp引物及其快速检测方法
技术领域：
本发明涉及一种黄瓜疫霉菌LAMP引物及其快速检测方法，专用于黄瓜疫霉菌高灵敏度快速分子检测 ，同时可用于田间黄瓜疫病的早期诊断和病菌的监测和鉴定，属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域。
背景技术：
黄瓜疫霉iPhytophthora me I on is Kat sura)由 Katsura 在 1968 年首次从摧病的黄瓜上分离得到，并鉴定为新种，随后中国、日本、埃及、土耳其、韩国、印度等国也相继报道此病原。由该菌引起的黄瓜疫病是中国黄瓜产区发生最严重的病害之一，主要为害植株的茎、叶及果实，从苗期到成株期均可发生。该病菌存活于土壤之中，潜育期短，传播速度快，侵染力强，对植物破坏性大。温湿度适合的情况下在极短时间内可导致病害大流行，因疫病为害而损失的黄瓜产量高达80%。黄瓜疫霉能侵染黄瓜、西葫芦、哈密瓜、冬瓜等作物。对发病植物进行快速准确的病害诊断、对无病植物材料和植物生长环境中病原菌的及时检测和监测是控制植物病害发生、流行和成灾的重要基础。因此建立黄瓜疫霉菌快速检测体系，早期对发病植株及土壤进行疫霉菌快速准确检测，对预测病害发生情况、及时采取有效的防治措施控制病原菌的传播和流行、减少经济损失都具有重要的理论和实际意义。目前对黄瓜疫霉菌的检测大多仍沿用传统的培养及鉴定方法，传统的病原菌检测技术是在分离得到病原物的基础上，通过形态学观察和柯赫氏法则来判断病原物的种类。整个过程常常需要耗费大量的劳动力和时间，一般需要几天才能完成。而且要求操作者具备专业的病原菌分离、形态学鉴定知识和丰富的经验。因此，以形态特征为基础的常规病害诊断技术，由于其耗时长，效率低，难以满足对黄瓜疫病诊断的实际需要，因其很容易错过病害防治的最佳时期。因此，建立一套快速、灵敏、准确的黄瓜疫霉菌检测诊断技术不仅非常必要，而且十分迫切。PCR技术为植物病原诊断提供了快速、灵敏、准确的优势，然而目前PCR特异性检测技术仍然需要PCR仪、电泳和凝胶成像系统等昂贵的专业仪器和分子生物学试剂，且需要分子生物学专业实验人员操作，限制了 PCR检测方法的推广应用。循环恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,简称 LAMP)是 2000 年由日本荣研株式会社Notomi等人开发的一种新型循环恒温核酸扩增技术。LAMP反应针对靶基因的6个位点设计出4条引物,利用一种链式置换活性的DNA聚合酶(fci DNA polymerase),在恒温条件下(60 - 650C )保温30 - 90分钟，即可完成扩增反应。由于LAMP反应的高效性和等温快速扩增的特点，在90分钟内可扩增IO9 - 101°倍产物。LAMP扩增产物的检测一般采用荧光染料目测观察、琼脂糖凝胶电泳和浊度观察等方法。由于LAMP反应简单、快速、高效、经济等特征，因而具有极为广泛的应用前景。目前LAMP检测主要应用于人畜病原物、食品安全和环境卫生的检测，在植物病原菌检测中报道极少，黄瓜疫霉菌的检测国内外均未见报道
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中黄瓜疫霉菌的生物学检测方法所需周期长、检测方法特异性差，灵敏度低的问题，提供一种黄瓜疫霉菌的LAMP检测引物以及结果可靠、易于操作、特异性强、灵敏度高的黄瓜疫霉菌的快速检测方法。实现本发明的目的包括下列步骤
1.LAMP引物的设计
我们从GenBank中下载黄瓜疫霉Ypt (登录号EF649778)基因序列，根据黄瓜疫霉Ypt基因序列，采用PrimerExplorer V4软件设计一种LAMP检测引物，包括2条外引物(F3和B3)和2条内引物(FIP和BIP)，引物序列分别为
F3 :5， -AAATTCGCACGATCGAGCT-3’
B3 :5’ -CCGTGACGTCGTACACCA-3’·FIP :5’ -GCGCTAAGTCGCGAATGTACCG-GACGGCAAGACCATCAAGC-3’
BIP :5’ -CTATTGTAGTGGGACACGGCCG-CGATAATACCGTGGGCACC-3’
2.黄瓜疫霉菌快速检测体系的建立
LAMP 检测25ul 反应体系中 F3 与 B3 各 O. 2-0. 25uM, FIP 与 BIP 各 I. 5-1. 7uM, 20mMTris-HCl, IOmM (NH4)2SO4, IOmM KCl，8mM MgSO4, O. 1% Tween-20,0. 8M Betaine, I. 4 mMdNTPs,8U Bst DNA聚合酶大片段，10_50ng DNA模板，不足部分用无菌双蒸水补足；LAMP反应条件为在 60-65°C温育 30-90 min，80°C保温 5-lOmin。更优选地，25ul反应体系中 F3 与 B3 各 O. 2uM，FIP 与 BIP各 L 6uM，20mM Tris-HCl,IOmM (NH4)2SO4, IOmM KCl,8mM MgSO4,0. 1% Tween-20,0. 8M Betaine, I. 4 mM dNTPs,8U BstDNA聚合酶大片段，25ng DNA模板，不足部分用无菌双蒸水补足；LAMP反应条件为在63°C温育 60 min,80°C保温 IOmin0所述的检测方法为荧光染料目测观察法和琼脂糖凝胶电泳法。所述荧光染料目测观察法在LAMP反应的最终扩增产物中加入Iul显色剂，所述显色剂为SYBR green I，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性。所述琼脂糖凝胶电泳法取2ul PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现LAMP特征性的梯形带判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。该方法可用于带菌的植株和土壤的高灵敏度快速检测。建立黄瓜疫霉菌快速、简便、特异性强、灵敏度高的监测技术体系，对于黄瓜疫霉菌引起病害显症之前的早期监测，确定病害防治最佳时期具有十分重要的意义。
本发明的关键性技术是黄瓜疫霉菌的高效特异扩增的引物序列及其扩增方法。为了验证黄瓜疫霉菌的特异弓I物序列，本发明以我国福建、广东、江苏等省的36株黄瓜疫霉菌和22种不同真菌及11种疫霉属和腐霉属卵菌为供试材料，采用CTAB法提取组织中黄瓜疫霉菌的DNA。具体方法如下取50mg冷冻干燥后的菌丝粉于I. 5ml离心管中，加入900ul 2%CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)提取液(提取液的配方为2% CTAB ；100 m mo I/L Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)，PH 8. O ；20mmol/L EDTA (乙二胺四乙酸二钠)，pH8. O ；1.4mol/L NaCl)和90ul 10% SDS (十二烷基苯磺酸钠)后混匀，于55 60°C水浴I. 5 h,每10 min振荡混勻一次，水浴I. 5h后离心(12，OOOrpm) 15min,取上清液加入与上清液等体积的酚/氯仿/异戊醇(酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1)，离心(12, OOOrpm) 5min,取上清液(水相),加入与上清液等体积的氯仿抽提一次(12，OOOrpm)离心5min,吸上清(350ul)，加0. I体积(35ul)的3mol/L NaAC溶液和2体积(700ul)的冰无水乙醇，-20°C下沉淀30min后12，OOOrpm离心5 min,轻轻地倒去上清液，加入700ul冰70%乙醇进行洗涤(稍离心，倾掉上清)，在超净工作台上自然晾干无酒精味后用IXTE (10mmol/LTris-HCl, O. lmmol/L EDTA, pH8. O)溶液进行溶解，得到DNA溶液，用紫外分光光度计检测DNA浓度并稀释至50ng/ul待用。经对供试菌株和36株黄瓜疫霉菌的特异性进行LAMP验证。LAMP 反应体系 25ul :包含F3 与 B3 各 O. 2uM，FIP 与 BIP各 I. 6uM，20mM Tris-HCl，IOmM (NH4)2SO4, IOmM KCl,8mM MgSO4,0· 1% Tween-20,0. 8M Betaine, I. 4 mM dNTPs,8U BstDNA聚合酶大片段，25ng DNA模板，不足部分用无菌双蒸水补足。除了来自我国福建、广东、江苏等省的36株黄瓜疫霉菌显色结果可观察到绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳检测出现LAMP特征性的梯形带外，检测了 22种真菌菌株和11种其他卵菌显色结果为橙色或琼脂糖凝胶电泳没有出现扩增条带。这说明该引物可被用于生产实践中发病组织及土壤中黄瓜疫霉菌快速可靠的检测和鉴定。·
①当在用于黄瓜组织中存在黄瓜疫霉菌时，采用NaOH快速裂解法提取黄瓜疫霉菌的DNA，具体过程如下(1)将黄瓜病叶或病茎洗净、晾干，剪取发病部位；(2)按Img病叶加入IOul (O. 5mol/L NaOH,O. 5%PVP)计量，将组织充分磨碎成糊，在12，OOOg离心机中离心5min ； (3)取上清20ul与等体积的O. I mol/L的Tris-HCl (ρΗ8· O)混合；(4)稀释10倍、100倍、1000倍液，分别取Iul原液、10倍、100倍、1000倍液作为PCR模板进行扩增。②当在用于黄瓜土壤中存在黄瓜疫霉菌时，采用土壤DNA提取法提取土壤中香蕉枯萎病菌的DNA。具体方法如下取过筛的土壤冷冻抽干24-48 h后加少量石英砂，倒入液氮充分研磨，将研磨后的土壤细粉分装至I. 5 ml离心管中，每管加入500 ul 0.4%脱脂奶粉溶液，涡旋混匀。12000 rpm离心15 min。取上清加入等体积蛋白酶K缓冲液，加终浓度为10 ug/ml蛋白酶K，55°C水浴1_3 h。水浴结束后，加入1/2体积的7. 5 M NH4AC溶液，上下颠倒混匀。12000 rpm离心15 min。吸上清加2倍体积无水乙醇_20°C沉淀(沉淀时间1.5 h)。沉淀结束后，12000 rpm离心15 min。用70%乙醇洗涤沉淀后倾去，室温晾干。每份样品所提DNA用10 ul TE (或无菌超纯水)溶解，？ 20°C保存备用。按如下LAMP反应体系和反应条件用所设计的引物进行检测
① LAMP 反应体系 25ul :包含 F3 与 B3 各 O. 2uM，FIP 与 BIP 各 I. 6uM，20mM Tris-HCl,IOmM (NH4)2SO4, IOmM KCl,8mM MgSO4,0. 1% Tween-20,0. 8M Betaine, I. 4 mM dNTPs,8U BstDNA聚合酶大片段，25ng DNA模板，不足部分用无菌双蒸水补足；LAMP反应条件为在63°C温育 60 min,80°C保温 IOmin0②在LAMP反应的最终扩增产物中加入Iul显色剂，所述显色剂为SYBR green I，显色结果观察到绿色荧光，或取2ul扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果出现LAMP特征性的梯形带，即可判断所述的黄瓜组织或土壤中存在黄瓜疫霉菌；否则所述的黄瓜组织或土壤中未存在黄瓜疫霉菌。本发明有益效果本发明方法适用于发病组织或土壤中黄瓜疫霉菌的快速可靠的检测和鉴定，对于农业生产中黄瓜疫霉菌引起的病害防治具有重要的实用价值。本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果
I、结果可靠本发明所设计出的LAMP检测引物，已经对源于中国福建、广东、江苏等地的黄瓜疫霉菌和带黄瓜疫霉菌的土样、植物组织进行了测试验证，因此结果可靠性具有充分的保证；
2、特异性强本发明所采用的LAMP引物是针对黄瓜疫霉菌基因序列中6个不同区域设计出4条特异性引物，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故特异性高。3、灵敏度高LAMP对黄瓜疫霉菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到10fg，比常规PCR检测高1000倍。4、实用性好本发明所设计出的LAMP引物，可用于带黄瓜疫霉菌的组织和土壤的高灵敏度快速检测，因此本方法的实用性强，可满足对带菌组织和土壤中存在的黄瓜疫霉菌进行快速可靠的检测和鉴定的需要；
5、操作简便快速应用本发明方法，对带黄瓜疫霉菌的组织和土壤进行检测可在I小时内完成，且LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，只需一个水浴锅即可，不需要复杂的仪·器设备和昂贵的分子试剂，结果肉眼直接可见。
图I为本发明黄瓜疫病菌的特异LAMP检测结果图。图I中A表示琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中泳道M为DL 2000 DNA marker，泳道I为阴性对照，泳道2为阳性对照，泳道3-8为黄瓜疫霉菌，泳道9-16为其他卵菌和真菌菌株；图I中B表示显色结果，其中第I管为阴性对照，第2管为阳性对照，第3 - 8管为黄瓜疫霉菌，第9 - 16管为其他卵菌和真菌菌株。图2为本发明黄瓜疫病菌的LAMP灵敏性检测结果图。图2中A表示琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中泳道M为DL 2000 DNA marker，泳道I - 10模板浓度分别为IOOOng,IOOng, 10ng, lng, 100 pg, 10 pg, I pg, 100 fg, 10 fg, and I fg;图 2 中 B 表示显色结果,其中第I - 10管模板浓度分别为IOOOng, IOOng, 10ng, Ing, 100 pg, 10 pg,
I pg, 100 fg, 10 fg, and I fg。图3为本发明对发病植株和薯块的检测结果图。图3中A表示琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中泳道I为阳性对照，泳道2为阴性对照，泳道3为发病组织，泳道4为发病土壤，泳道5为健康组织；泳道M为DL 2000 DNA marker ;图3中B表示显色结果，其中第I管为阳性对照，第2管为阴性对照，第3管为发病组织，第4管为发病土壤，第5管为健康组织。
具体实施例方式本发明的技术内容包括黄瓜疫霉菌的LAMP检测引物，LAMP引物及其序列分别为 F3 :5， -AAATTCGCACGATCGAGCT-3’
B3 :5’ -CCGTGACGTCGTACACCA-3’
FIP :5’ -GCGCTAAGTCGCGAATGTACCG-GACGGCAAGACCATCAAGC-3’
BIP :5’ -CTATTGTAGTGGGACACGGCCG-CGATAATACCGTGGGCACC-3’
利用LAMP引物检测黄瓜疫霉菌显色结果可观察到绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特征性的梯形带。
主要试剂-.Bst DNA聚合酶大片段购自英国NEB公司；DNA marker购自宝生物工程大连有限公司；其余试剂均购自上海生工生物技术有限公司。引物由上海生工生物技术有限公司合成。实施例I :LAMP引物对黄瓜疫霉菌的特异性扩增 I.黄瓜疫霉菌的LAMP特异检测
① LAMP 反应体系 25 ul :包含 F3 与 B3 各 O. 2uM，FIP 与 BIP 各 I. 6uM，20mM Tris-HCl,IOmM (NH4)2SO4, IOmM KCl,8mM MgSO4,0. 1% Tween-20,0. 8M Betaine, I. 4 mM dNTPs,8U BstDNA聚合酶大片段，25ng DNA模板，不足部分用无菌双蒸水补足；LAMP反应条件为在63°C温育 60 min,80°C保温 IOmin0②在LAMP反应的最终扩增产物中加入Iul显色剂，所述显色剂为SYBR green I，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性。或取2ul扩增产物用2%琼脂糖凝 胶电泳检测，如果出现LAMP特征性的梯形带判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。2.检测结果
检测的特异性除了来自我国福建、广东、江苏等省的36株黄瓜疫霉菌显色结果可观察到绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特征性的梯形带外，检测了 11种其他卵菌和22种真菌菌株显色结果为橙色或琼脂糖凝胶电泳没有出现扩增条带(部分结果见图1)，说明此引物具有很强的特异性。实施例2 =LAMP弓I物对黄瓜疫霉菌的灵敏性检测 I.黄瓜疫霉菌的LAMP灵敏性检测
采用10倍浓度系列稀释法将提取的黄瓜疫霉菌DNA稀释成lOOOng，IOOng, IOng,lng, 100 pg, 10 pg, I pg, 100 fg, 10 fg, and I fg 共 10 个不同浓度梯度。①LAMP 反应体系 25ul :包含 F3 与 B3 各 0. 2uM, FIP 与 BIP 各 I. 6uM, 20mMTris-HCl, IOmM (NH4)2SO4, IOmM KCl，8mM MgSO4, 0.1% Tween-20,0. 8M Betaine, I. 4 mMdNTPs,8U Bst DNA聚合酶大片段，25ng DNA模板，不足部分用无菌双蒸水补足；LAMP反应条件为在63°C温育60 min，80°C保温lOmin。②在LAMP反应的最终扩增产物中加入Iul显色剂，所述显色剂为SYBR green I，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性。或取2ul扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现LAMP特征性的梯形带判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。2.检测结果黄瓜疫霉菌LAMP灵敏性检测，显色结果可观察到绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特征性的梯形带,检测灵敏度可达IOfg (见图2)。实施例3 :发病组织或土壤中黄瓜疫霉菌的检测。I.样品采集植物组织样品采自福建福州市黄瓜生产基地；土壤样品采自福建省龙海市黄瓜生产基地。2. DNA提取及检测
发病植物组织采用NaOH快速裂解法提取黄瓜疫霉菌DNA，发病土壤采用土壤DNA提取法提取黄瓜疫霉菌的DNA。按下述方法进行LAMP检测
① LAMP 反应体系 25 ul :包含 F3 与 B3 各 O. 2uM，FIP 与 BIP 各 I. 6uM，20mM Tris-HCl,IOmM (NH4)2SO4, IOmM KCl,8mM MgSO4,0. 1% Tween-20,0. 8M Betaine, I. 4 mM dNTPs,8U BstDNA聚合酶大片段，25ng DNA模板，不足部分用无菌双蒸水补足；LAMP反应条件为在63°C温育 60 min,80°C保温 IOmin0②在LAMP反应的最终扩增产物中加入Iul显色剂，所述显色剂为SYBR green I，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性。或取2ul扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现LAMP特征性的梯形带判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。3.检测结果
如图3所示，发病组织或土壤中感染黄瓜疫霉菌，显色结果可观察到绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特征性的梯形带，健康组织显色结果则观察到橙色荧光或琼脂糖凝胶电泳未出现LAMP特征性的梯形带。
权利要求
1.一种黄瓜疫霉菌的LAMP引物，其特征在于所述LAMP引物如下F3 :5， -AAATTCGCACGATCGAGCT-3’ ；B3 :5’ -CCGTGACGTCGTACACCA-3’ ；FIP :5’ -GCGCTAAGTCGCGAATGTACCG-GACGGCAAGACCATCAAGC-3’ ；BIP :5’ -CTATTGTAGTGGGACACGGCCG-CGATAATACCGTGGGCACC-3’。
2.—种黄瓜疫霉菌的LAMP检测方法，其特征在于利用权利要求I所述的LAMP引物进行 LAMP 反应，25ul 反应体系中 F3 与 B3 各 O. 2-0. 25uM, FIP 与 BIP 各 I. 5-1. 7uM, 20mMTris-HCl, IOmM (NH4)2SO4, IOmM KCl，8mM MgSO4, O. 1% Tween-20,0. 8M Betaine, I. 4 mMdNTPs,8U Bst DNA聚合酶大片段，10_50ng DNA模板，不足部分用无菌双蒸水补足；LAMP反应条件为在 60-65°C温育 30-90 min，80°C保温 5-lOmin。
3.根据权利要求2所述的黄瓜疫霉菌LAMP检测方法，其特征在于在LAMP反应的扩增产物中加入Iul显色剂，所述显色剂为SYBR green I，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性；或取2ul扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，没有出现则判断为阴性。
全文摘要
本发明公开了一种黄瓜疫霉菌LAMP引物及其快速检测方法，专用于黄瓜疫霉菌特异检测。主要采用设计了一种黄瓜疫霉菌的LAMP引物，见SEQNO.1-SEQNO.4。经过恒温扩增和加入SYBRgreenⅠ显色剂显色或琼脂糖凝胶电泳检测，可观察到绿色荧光或出现LAMP特征性的梯形带。所发明的LAMP引物及其用法可被用于生产实践中黄瓜疫霉菌感染的植株和土壤中黄瓜疫霉菌的快速、灵敏、准确的检测，同时可用于田间病害的早期诊断和病菌的监测和鉴定，为黄瓜疫霉菌引起的病害防治提供可靠的技术和理论依据。
文档编号C12R1/645GK102899416SQ20121040964
公开日2013年1月30日 申请日期2012年10月24日 优先权日2012年10月24日
发明者李本金, 陈庆河, 翁启勇, 兰成忠, 刘裴清 申请人:福建省农业科学院植物保护研究所