专利名称：一株可高效分解雌激素的恶臭假单胞菌及其获取与应用的制作方法
技术领域：
本发明属基因工程技术领域，涉及一株可高效分解雌激素的恶臭假单胞菌及其获取与应用。
背景技术：
雌激素作为环境中典型内分泌干扰物质，会以直接或间接的方式在生物体内蓄积与富集；在体内与激素受体结合后，环境雌激素会引起生物的神经系统失调、内分泌紊乱、 免疫能力下降和生殖失常等，具有很强的致癌性与致病性，直接威胁着人类社会与生物圈的生存与繁衍，已引起了学术界与社会的广泛关注。雌酮(Ε1)、17-β-雌二醇(Ε2)和雌三醇(Ε3)是由人和动物的卵巢分泌的天然雌激素，可随着动物与人体的排泄物排放进入污水处理厂、土壤、农田等环境中。人工合成雌激素17-α-乙炔基雌二醇(ΕΕ2)是低剂量口服避孕药、月经不调治疗药和更年期治疗药的主要成分，亦会被排泄到污水处理厂中。牲畜养殖业排放的雌激素亦会通过堆肥发酵等处理处置后通过施肥进入农田土壤中。常规活性污水处理系统不能有效去除原水中的雌激素，雌酮与17-β -雌二醇虽能得到部分降解，17- α -乙炔基雌二醇却基本不被降解，导致受纳水体及土壤中ng/L水平的雌激素被检出。多个国家污水处理厂出水中的雌激素含量检测显示，雌酮、17 β -雌二醇与17 α -乙炔雌二醇的平均浓度范围在Ι-llng/L。雌激素随着污水处理厂出水排放进入河流中，在环境中累积。研究表明，河流中可检出ng/L级的雌酮、17 β-雌二醇与17 α-乙炔雌二醇，造成环境的二次污染。研究还发现，ng/L水平的雌酮、17 β -雌二醇与17 α-乙炔雌二醇可导致雄鱼的雌性化，是引起鱼类雌性化的主要物质。毒理研究表明，不同雌激素物质的雌激素效应大小依次为17 α-乙炔雌二醇> 17 β-雌二醇>雌酮。2002-2003年间，日本东京湾近污水处理厂的水域内，发现多条鲻鱼、青麟雄鱼体中存在雌性鱼才会发育的卵细胞；这一鱼类雌性化现象主要是由于长期排入东京湾的污水处理厂的出水中含有的雌激素类物质所致。因此，环境雌激素的污染对于水源水质、城镇供水、公共卫生及生态质量等方面构成的潜在威胁不容忽视。污水处理厂在阻止雌激素排放到环境中担负着重要的作用。因此，必须探索污水处理厂对雌激素的有效的处理方法。生物降解已成为去除环境雌激素的重要方法之一。通常是利用从环境中分离获得的微生物菌株或菌群，以雌激素类物质为碳源或营养物质，经过复杂的代谢过程，最终将其完全分解为无害的终产物。因而，寻找能够有效降解雌激素的微生物菌株或菌群已成为环境雌激素分解的研究热点之一。近年来，一些可降解雌激素的微生物菌株陆续被发现，如睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosterom),佐氏红球菌(Rhodococcus zopfii)与马红球菌(Rhodococcus equi),再育键刀菌(Fusarium proliferatum),欧洲亚硝化单胞菌(Nitrosomonas europaea),鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)和假单胞菌(Pseudomonas sp.)等。睾丸酮丛毛单胞菌可利用多种激素类物质为单一碳源和能源；欧洲亚硝化单胞菌可高效降解雌二醇，而对17 α -乙炔基雌二醇的降解效率略差；鞘氨醇杆菌JCR5则对17 α -乙炔基雌二醇的分解率可达87%;此外，香茅假单胞菌(P. citronellilis)SS-2对雌二醇和雌酮的分解率均达到99%，对17 α -乙炔基雌二醇的分解效率为93. 6%。这些研究显示微生物菌株在降解环境雌激素、修复环境雌激素污染方面具有重要意义。尽管上述微生物均具有降解雌激素的能力，但其降解效率、降解周期和底物偏好等性质上存在较大差异，在实际应用中单一菌株难于实现对多种雌激素类物质的有效分解。同时，尽管某些微生物在实验室模拟条件下可有效分解雌激素，但由于实际环境的雌激素浓度仅为ng级水平，根本不能支持其生长，因而影响其降解效率。如鞘氨醇单胞菌KC8在ng级的雌激素条件下根本不生长。因此，获得一株可稳定高效地分解多种雌激素类物质的微生物菌株是进行有效的环境雌激素生物降解与环境修复的前提条件。
发明内容
本发明的目的，就是为了提供一株可高效分解雌激素的恶臭假单胞菌及其获取与应用，该恶臭假单胞菌可稳定高效地分解多种雌激素类物质，可有效地用于环境雌激素生 物降解与环境修复。本发明所提供的恶臭假单胞菌SJTE-I来源于污水处理厂活性污泥中，经过人工富集、筛分及纯化所得。SJTE-I菌落呈圆形，隆起，菌落呈淡黄色，边缘光滑平整湿润，阳光下观察可见荧光，革兰氏染色呈阴性，直或弯的杆菌，单个和成对，无芽孢，30°C下生长良好。经对该菌株的16S rDNA的鉴定与序列分析,表明该菌株为恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)。该恶臭假单胞菌SJTE-I菌株已于2012年9月19日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号)保藏，登记入册编号为CGMCCNo. 6585。为了实现本发明的目的，本发明采用了以下技术方案一株恶臭假单胞菌，命名为SJTE-I，其保藏编号为CGMCC No. 6585。上述的恶臭假单胞菌的16S rDNA片段的序列如SEQ ID NO. I所示。上述恶臭假单胞菌的获取方法，包括以下步骤A、采集污水处理厂脱氮除磷工艺系统中的活性污泥作为微生物源；B、以雌激素为碳源，制备含有50mg/L雌激素的无机培养基，按照3%的活性污泥接种量接种于含有IOOmL上述无机培养基的500mL三角瓶中，用盐酸调pH值至7. 0-7. 2，121°C 灭菌 20min ；C、待培养基温度降低到30°C左右时，在超净台下接种；D、接种后在30°C、180rpm的恒温摇床培养箱中进行富集培养；E、重复培养七次后，在固体培养基平板上反复划线培养，直至分离出单菌株，之后再将菌株接种入上述无机培养基内驯化，上述操作重复多次，得到纯化的恶臭假单胞菌菌株，命名为SJTE-I。上述恶臭假单胞菌的获取方法，其中，所述无机培养基的无机成分如下=K2HPO4,O. lg/L ； (NH4)2HPO4,0. lg/L ；MgS04 · 7Η20，0· 02g/L ;FeCl3，0. Olg/L ；CaCl2 · 2Η20，0· lg/L ；NaCl，0· lg/L ;余量为水。上述恶臭假单胞菌的获取方法，其中，所述雌激素为雌酮、17-β-雌二醇、雌三醇或17-α -乙炔基雌二醇。
上述恶臭假单胞菌的应用，用于环境中雌激素类物质的分解与去除。上述恶臭假单胞菌的应用，其中，所述雌激素类物质包括雌酮、17-β-雌二醇、雌三醇或17-α -乙炔基雌二醇。本发明的SJTE-I菌株在24小时内能分别将初始浓度为lmg/L的雌酮、17-β -雌二醇和雌三醇降解掉99%，在168小时内能将初始浓度为50mg/L的雌酮、17-β-雌二醇和雌三醇降解95%以上，对初始浓度为5mg/L的17-α -乙炔基雌二醇降解率大于90%。17-β-雌二醇的降解过程中有雌酮的生成，该雌酮亦被逐渐降解为无雌激素活性的物质。降解反应符合一级动力学反应定律。依据本发明，由于恶臭假单胞菌Pseudomonas putida SJTE-1菌株具有高效降解环境中的天然雌激素雌酮、17 β-雌二醇、雌三醇与合成雌激素17 α-乙炔雌二醇的特性，因此SJTE-I菌株可应用于含有雌激素的废污水治理或土壤修复。本发明与现已发现的雌激素降解菌相比，其降解雌酮、17β_雌二醇、雌三醇与17 α-乙炔雌二醇的效率显著提高，降解周期明显缩短。
图I为本发明的恶臭假单胞菌Pseudomonas putida SJTE-1菌株的平板划线图；图2为本发明的恶臭假单胞菌Pseudomonas putida SJTE-1菌株以雌酮(Ε1)、17β-雌二醇(Ε2)、雌三醇(Ε3)与17 α-乙炔雌二醇(ΕΕ2)为单一碳源时菌株的生长曲线；图3为本发明的恶臭假单胞菌Pseudomonas putida SJTE-1菌株对lmg/L雌酮 (Ε1)、17β-雌二醇(Ε2)和雌三醇(Ε3)的降解曲线；图4为本发明的恶臭假单胞菌Pseudomonas putida SJTE-I菌株降解5mg/L17a-乙炔雌二醇(EE2)的曲线图；图5为本发明的恶臭假单胞菌Pseudomonas putida SJTE-1菌株降解17 β -雌二醇(Ε2)过程中生成的雌酮(El)浓度随时间变化图。具体实施方法下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但本发明的实施不局限于此。一、恶臭假单胞菌Pseudomonasputida SJTE-I菌株的获取与保藏采集污水处理厂脱氮除磷工艺系统中的活性污泥作为微生物源，冷藏运回实验室。制备含有50mg/L雌激素为唯一碳源的无机培养基，按照3%的活性污泥接种量接种于含有IOOmL上述无机培养基的500mL三角瓶中。培养基中所含无机成分为=K2HPO4,0. lg/L ；(NH4)2ΗΡ04，0· lg/L ；MgS04 ·7Η20，0· 02g/L ；FeCl3,0. Olg/L ；CaCl2 ·2Η20，0· lg/L ；NaCl,0. lg/L ;蒸馏水定容到1000mL。盐酸调pH值为7. 0-7. 2，高压灭菌锅121°C灭菌20min。待培养基温度降低到30°C左右时，在超净台下接种。污泥接种后在30°C、ISOrpm的恒温摇床培养箱中进行富集培养。重复培养七次后，在固体培养基平板(琼脂20. 0g/L)上反复划线培养，直至分离出单菌株。之后再将菌株接种入上述无机培养基内驯化，上述操作重复多次，得到纯化的可降解雌酮、17 β -雌二醇、雌三醇与17 α -乙炔雌二醇的SJTE-I菌株，平板划线图如图I所示。该菌落呈圆形，隆起，菌落呈淡黄色，边缘光滑平整湿润，阳光下观察可见荧光，30°C下生长良好。纯化后菌株加甘油后于_80°C冷冻保藏。本发明的SJTE-I菌株已于2012年9月19日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，登记入册编号为 CGMCC No. 6585。二、恶臭假单胞菌Pseudomonasputida SJTE-1菌株的鉴定将分离出的SJTE-I菌株进行16S rDNA序列的扩增、序列测定与数据库比对。利用基因组提取试剂盒(TIANGEN，北京)提取SJTE-I菌株的基因组DNA，之后，利用16S rDNA片段扩增与检测试剂盒(Takara，大连)扩增该菌株的16S rDNA片段并测定序列。SJTE-I菌株的 16S rDNA 序列如 SEQ ID NO. I 所不。与 NCBI 数据库(http://www. ncbi. nlm. nih.gov/)比对,表明该SJTE-I菌株为恶臭假单胞菌Pseudomonas putida,菌株为无芽孢杆菌，单个和成对，属革兰氏阴性菌，严格好氧，化能异养。三、恶臭假单胞菌Pseudomonas putida SJTE-1菌株对雌酮、17 β -雌二醇、雌三醇与17 α -乙炔雌二醇的降解能力将Pseudomonas putida SJTE-1菌株划固体培养基平板，30°C过夜培养。挑取单克隆，分别接种于以lmg/L雌酮、17 β -雌二醇、雌三醇与17 α -乙炔雌二醇为唯一碳源的液体培养基中，30°C，120rpm恒温振荡培养箱中培养7天。采集不同时间点的2个平行样品，一个样品利用紫外分光光度仪(UV-2100spectrophotometer,Unic)测定600nm吸光度值用以表不微生物生长情况，如图2所不。另一个样品中加入等体积乙臆混勻，以O. 22 μ m有机系尼龙滤膜(13mm，Millipore)过滤后，采用高效液相色谱(HPLC，Waters 1525)测定雌激素浓度。检测器为 UV (Dual λ Absorbance Detector, Water2487)，色谱柱为 Nova-Pak C18 柱(4 μ m粒径、3. 9mmX 150mm I. D. , Waters),流动相体积比为乙腈水=I I,检测波长为280nm，流速为lmL/min。不同雌激素的浓度测定结果如图3和图4所示。在雌激素为唯一 碳源的培养条件下，SJTE-I菌株在24小时内能分别将初始浓度为lmg/L的雌酮、17- β -雌二醇和雌三醇降解掉99%，在168小时内能将初始浓度为50mg/L的雌酮、17-β -雌二醇和雌三醇降解95%以上，对初始浓度为5mg/L的17-α -乙炔基雌二醇降解率大于90%。降解反应符合一级动力学反应定律。本发明发现SJTE-I菌株可高效降解雌酮、17 β -雌二醇、雌三醇与17 α -乙炔雌二醇，且该菌株对17 β -雌二醇的分解速度最快。图5表明，在SJTE-I菌株对17 β -雌二醇的降解过程中可观察到有雌酮生成，其雌酮亦被逐渐降解为无雌激素活性的物质。序列表〈110〉上海交通大学〈120〉一株可高效分解雌激素的恶臭假单胞菌及其获取与应用<160>1<170>PatentIn version<210>1<211>1495<212>DNA〈213> 恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)SJTE-I 16s rDNA 序列〈400〉Itgaattgtat ctggcctaga ttgacgctgg cggcaggcct aacacatgca agtcgagcgg 60atgacgggag cttgctcctt gattcagcgg cggacgggtg agtaatgcct aggaatctgc 120ctggtagtgg gggacaacgt ttcgaaagga acgctaatac cgcatacgtc ctacgggaga 180
权利要求
1.一株可高效分解雌激素的恶臭假单胞菌菌株，命名为SJTE-1，其保藏编号为CGMCCNo. 6585。
2.根据权利要求I所 述的恶臭假单胞菌，其特征在于，该恶臭假单胞菌的16SrDNA片段的序列如SEQ ID NO. I所示。
3.根据权利要求I所述的恶臭假单胞菌的获取方法，其特征在于，包括以下步骤 A、采集污水处理厂脱氮除磷工艺系统中的活性污泥作为微生物源； B、以雌激素为碳源，制备含有50mg/L雌激素的无机培养基，按照3%的活性污泥接种量接种于含有IOOmL上述无机培养基的500mL三角瓶中，用盐酸调pH值至7. 0-7. 2，121°C灭菌20min ； C、待培养基温度降低到30°C左右时，在超净台下接种； D、接种后在30°C、180rpm的恒温摇床培养箱中进行富集培养； E、重复培养七次后，在固体培养基平板上反复划线培养，直至分离出单菌株，之后再将菌株接种入上述无机培养基内驯化，上述操作重复多次，得到纯化的恶臭假单胞菌菌株，命名为 SJTE-I。
4.根据权利要求3所述的恶臭假单胞菌的获取方法，其特征在于所述无机培养基的无机成分如下=K2HPO4,0. lg/L ； (NH4)2HPO4,0. lg/L ；MgS04 · 7Η20，0· 02g/L ;FeCl3，0. Olg/L ；CaCl2 · 2Η20，0· lg/L ；NaCl,0. lg/L ;余量为水。
5.根据权利要求3所述的恶臭假单胞菌的获取方法，其特征在于所述雌激素为雌酮、17-β-雌二醇、雌三醇或17-α-乙炔基雌二醇。
6.根据权利要求I所述的恶臭假单胞菌的应用，用于环境中雌激素类物质的分解与去除。
7.根据权利要求6所述的恶臭假单胞菌的应用，其特征在于所述雌激素类物质包括雌酮、17-β-雌二醇、雌三醇或17-α -乙炔基雌二醇。
全文摘要
一株可高效分解雌激素的恶臭假单胞菌菌株，命名为SJTE-1，其保藏编号为CGMCC No.6585本发明的恶臭假单胞菌能以天然或合成雌激素作为唯一碳源生长，能够高效降解雌酮(E1)、17-β-雌二醇(E2)、雌三醇(E3)及17-α-乙炔基雌二醇(EE2)，可用于雌激素污染的环境修复。在雌激素为唯一碳源的培养条件下，菌株SJTE-1在24小时内能分别将初始浓度为1mg/L的雌酮、17-β-雌二醇和雌三醇降解掉99％，在168小时内能将初始浓度为50mg/L的雌酮、17-β-雌二醇和雌三醇降解95％以上，对初始浓度为5mg/L的17-α-乙炔基雌二醇降解率大于90％。17-β-雌二醇的降解过程中有雌酮的生成，其雌酮亦被逐渐降解为无雌激素活性的物质。
文档编号C12N1/20GK102876619SQ20121040878
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月23日 优先权日2012年10月23日
发明者梁如冰, 刘建华 申请人:上海交通大学