专利名称：一种寡聚核苷酸的修饰方法，由该方法得到的修饰寡聚核苷酸及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种寡聚核苷酸的修饰方法，还涉及由该方法制备得到的修饰寡聚核苷酸及其应用。本发明属于生物技术领域。
背景技术：
基于核酸的一些药物如反义寡核苷酸、肽核酸以及很有希望的小干扰RNA(SiRNA)要想发展成为有用的治疗药物，提高其跨膜能力以及耐稳定性是必须解决的关键问题之一。很多技术已经被用来提高这类化合物的药代动力学性质，例如，通过寡核苷酸序列上的碱基修饰，糖环修饰以及骨架替换等策略提高其血清稳定性；通过脂质体和纳米聚合物包裹等方法提高寡核苷酸的跨膜，这些方法有其优势也有不足。如脂质体转运引起不同程度的副作用，骨架修饰导致与靶mRNA结合能力降低，进而导致活性下降。而通过将透膜性肽、胆固醇等疏水性分 子缀合于寡核苷酸的末端来提高其跨膜能力已有很多研究。此外寡核苷酸硫代修饰能够提高耐酶稳定性也有很多报道。但是将两种策略进行组合，利用两种修饰策略的优势进行组合修饰目前还没有报道。因此，这里我们提供的策略组合，能够有效利用两种策略的优势，同时避免单种策略的不足，提高寡聚核苷酸的成药性。
发明内容
本发明提供了一种寡聚核苷酸的修饰方法，即组合末端修饰和中间磷酸部分修饰两种策略，如将透膜性的多肽或者疏水性分子缀合于寡聚核苷酸末端的同时，对序列进行硫代或硒代修饰。通过这种策略修饰能够提高寡核苷酸的药代动力学性质，进而提高其成药性。本发明的一种寡聚核苷酸的修饰方法，其特征在于包括以下步骤:( I)合成缀合物分子:所述的缀合物分子为功能性分子，包括多肽，醇类、靶向性分子以及人体必需的分子;(2)连接臂的形成缀合物分子与寡聚核苷酸共价缀合的连接臂是通过化学反应形成共价键得到；(3)寡聚核苷酸的合成及修饰在合成的连有连接臂的缀合物分子的基础上进一步合成寡聚核苷酸，并对寡聚核苷酸上磷酸部分非桥联的氧原子用硫原子或硒原子进行取代，完成目标寡聚核苷酸的修饰。 在本发明中，优选的，步骤(I)中所述的多肽包括透膜性肽序列，所述的醇类包括疏水性的油醇、胆固醇，所述的靶向性分子包括甘露糖、半乳糖，所述的人体必需的分子包括维生素E以及抗体。在本发明中，优选的，步骤(2)中所述的共价键包括磷酸二酯键、酰胺键、二硫键、硫醚键以及通过Click反应以及Diels-Alder反应构建的共价键。在本发明中，优选的，步骤(3)中所述的寡聚核苷酸包括反义寡核苷酸、RNA、适配体、二聚物以及三聚物。在本发明中，步骤(3)中硫代修饰或硒代修饰的数量为寡聚核苷酸中的一个至序列中全部的磷酸被修饰。在本发明中，步骤(3)中缀合修饰的末端位于寡聚核苷酸的3’端、5’端或者同时位于3’端和5’端。进一步的，本发明还提供了由以上任一项所述的方法合成的修饰寡聚核苷酸。采用的本发明的方法制备得到的修饰寡聚核苷酸其由四部分组成，如图1所示，I为缀合物分子；11为连接臂；111为寡聚核苷酸；IV为修饰位点。在本发明的一个具体实施例中，所述的修饰寡聚核苷酸中缀合物分子为一信号肽序列，寡聚核苷酸为编码转化生长因子3型受体mRNA的反义寡核苷酸，且从5’端起第6_16为核苷酸之间的磷酸骨架中非桥联的氧原子被硫原子取代，所述的信号肽序列与所述的反义寡核苷酸的3’端通过共价键缀合。更进一步的，本发明还提供了所述的修饰寡聚核苷酸在制备拮抗转化生长因子3型受体药物中的应用。
图1为本发明的修饰后的寡核苷酸结构示意图；图2为本发明实施例的反应流程图；图3为修饰反义核酸MlOS显示剂量依赖性的活性；图4为天然未修饰反义核酸不具有剂量依赖性。
具体实施例方式下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。本发明的一种寡聚核苷酸的修饰方法，包括以下步骤:( 1)缀合物分子的合成方法根据本发明，缀合的分子多为一些功能性的分子，如透膜性肽序列，疏水性的油醇、胆固醇，靶向性分子如甘露糖、半乳糖，人体必需的分子如维生素E以及抗体等。这些功能性分子大多可以商业获得。对于需要合成的分子如透膜性肽等可用成熟的Fmoc，Boc化学制备。(2)连接臂的形成根据本发明，将缀合物分子与寡核苷酸链接的连接臂主要通过化学反应形成共价键得到。这样的共价键均属于常规的化学反应，包括但不限于磷酸二酯键、酰胺键、二硫键、硫醚键、通过“Click”反应以及Diels-Alder反应(Kui Lu, Qun-Peng Duan等，Bioconjugate Chem.2010, 21, 187 - 202 ；Natarajan Venkatesan and Byeang Hyean Kim,Chem.Rev.2006，106，3712-3761)形成的共价键等。(3)寡核苷酸磷酸骨架部分的修饰
磷酸骨架修饰主要包括但不限于硫代，硒代修饰等。以硫代修饰为例，可以采取全部硫代或者部分硫代，通过购买商用的硫代试剂如EDITH，DTD, PADS, DDTT以及Beaucage试剂(结构式如下所示)，在寡核苷酸合成过程中通过对合成仪设置而实现任何单位点、部分或者全部硫代。
O
S-SS-S
o、0丨 DDTTEDITH
Beaocage reagent (sutfurizing reagent 11)
xn^s^syn'-
PADS °OTD 0为了更好地理解本发明，通过实例进行说明。实施例1以氨化的CPG树脂为载体，首先通过Spacer增加树脂的溶胀性及降低反应空间位阻。然后米用Boc方法合成/[目号妝序列，合成的彳目号条序列为Lys-Ala-Leu-Leu-Ala-Leu,脱除末端氨基Boc保护基，与2，2- 二甲基-3-甲氧基三苯甲氧基丙酸缩合，最后用标准亚磷酰化法在ABI 394合成仪上合成目标寡核苷酸，该目标寡核苷酸为靶向miR-328的反义寡核苷酸，其具体序列为5’ -ACGGAAGGGCAGAGAGGGCCAG-3’，miR-328能够使靶转化生长因子3型受体(TGFiiRIII)的表达下 降，通过反义寡聚核苷酸沉默miR-328从而使受体蛋白表达增加。合成规模为I μ mol，碱基偶联时间为30秒，重复偶联3次。硫代序列合成时，用硫代试剂苯乙酰二硫化物(PADS，0.2M)代替12液，并延长氧化时间由15秒延长至600秒，反应流程图2所示。利用上述实例我们制备了反义核酸3’端肽缀合修饰且从5’端起第6-16位核苷酸之间的磷酸骨架硫代修饰的寡核苷酸修饰物(MlOS)，蛋白水平实验表明，这种修饰物有明显的剂量依赖性，而未修饰的天然序列则没有显示剂量依赖性的特点，如图3、图4所示。本文显示并详细描述的信息足以实现本发明的上述目的，因此本发明的优选实施方案代表本发明的主题，该主题为本发明所广泛涵盖。本发明的范围完全涵盖其它对本领域技术人员来说显而易见的实施方案，因此，本发明的范围不被除所附权利要求之外的任何内容所限制，其中除了明确说明外，所用元素的单数形式并不是指“一个和唯一”，而是指“一个或更多”。对本领域一般技术人员来说，所有公知的上述优选的实施方案和附加实施方案部分的结构、组成和功能上的等价物因此引入本文作参考，而且试图被本发明的权利要求所涵盖。此外，不需要某种设备或方法来表达本发明所解决的每个问题，因为它们都已包括在本发明的权利要求之内。另外，无论本发明公开事实中的所有部分、成分，或者方法步骤是否在权利要求中被明确叙述，它们都没有贡献给公众。但是，对本领域普通技术人员来说，很明显在不背离如所附权利要求中所阐明的本发明的实质和范围的前提下，可以在形式、试剂和合成细节上做出各种改变和修饰。
权利要求
1.一种寡聚核苷酸的修饰方法，其特征在于包括以下步骤: (1)合成缀合物分子 所述的缀合物分子为功能性分子，包括多肽，醇类、靶向性分子以及人体必需的分子； (2)连接臂的形成 缀合物分子与寡聚核苷酸共价缀合的连接臂是通过化学反应形成共价键得到； (3)寡聚核苷酸的合成及修饰 在合成的连有连接臂的缀合物分子的基础上进一步合成寡聚核苷酸，并对寡聚核苷酸上磷酸部分非桥联的氧原子用硫原子或硒原子进行取代，完成目标寡聚核苷酸的修饰。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(I)中所述的多肽包括透膜性肽序列，所述的醇类包括疏水性的油醇、胆固醇，所述的靶向性分子包括甘露糖、半乳糖，所述的人体必需的分子包括维生素E以及抗体。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中所述的共价键包括磷酸二酯键、酰胺键、二硫键、硫醚键以及通过Click反应以及Diels-Alder反应构建的共价键。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中所述的寡聚核苷酸包括反义寡核苷酸、RNA、适配体、二聚物以及三聚物。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中硫代修饰或硒代修饰的数量为寡聚核苷酸中的一个至序 列中全部的磷酸被修饰。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中缀合修饰的末端位于寡聚核苷酸的3’端、5’端或者同时位于3’端和5’端。
7.由权利要求1-6任一项所述的方法合成的修饰寡聚核苷酸。
8.如权利要求7所述的修饰寡聚核苷酸，其特征在于所述的修饰寡聚核苷酸中缀合物分子为一信号肽序列，寡聚核苷酸为编码转化生长因子3型受体mRNA的反义寡核苷酸，且从5’端起第6-16位的核苷酸之间的磷酸骨架中非桥联的氧原子被硫原子取代，所述的信号肽序列与所述的反义寡核苷酸的3’端通过共价键缀合。
9.权利要求8所述的修饰寡聚核苷酸在制备拮抗转化生长因子3型受体药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种寡聚核苷酸的修饰方法，由该方法得到的修饰寡聚核苷酸及其应用。本发明的目的是通过这种修饰改善目的寡聚核苷酸的药代动力学性质和成药性。本发明的一种寡聚核苷酸修饰方法，结合了寡核苷酸末端修饰和骨架修饰两种策略，能够有效解决寡聚核苷酸药物的一些不足，具有潜在的药物开发前景。本发明的一种寡聚核苷酸的修饰方法，方法简单，容易操作，便于规模化制备。
文档编号C12N15/113GK103243086SQ20121040783
公开日2013年8月14日 申请日期2012年10月23日 优先权日2012年10月23日
发明者杨振军, 王晓锋, 初文峰, 杨宝峰 申请人:北京大学