专利名称：一株黄单胞菌突变体及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属基因工程技术领域，涉及一株黄单胞菌突变体及其构建方法和应用。
背景技术：
纤维素是地球上储量最丰富的可再生资源，通过化学或生物分解，可转化为许多高附加值的产品，如乙醇、生物燃料等。微生物通过产生与分泌一系列纤维素酶来分解纤维素，产生中间产物葡萄糖，之后再进一步转化为下游的其它化学物质。与化学转化法相比，微生物转化更为简单、低耗与环保。为了提高最终高附加值产品的产量，研究者致力于通过增加中间产物即可溶性糖的浓度来实现。常见的方法有筛选新的纤维素酶高表达菌株；基因工程改造增强现有菌株的纤维素酶表达水平，降低终产物的抑制效应；增强菌株的纤维素酶向外分泌的效率等。但是，由于葡萄糖是绝大多数微生物的优势碳源，在微生物生长过程中会被优先 利用。这会导致即使纤维素向葡萄糖转化的效率被提升，但是绝大部分由纤维素分解产生的葡萄糖会被微生物优先利用，不仅使葡萄糖累积量降低，还会抑制微生物分解纤维素的效率。因此，如何降低生物转化过程中的中间产物被消耗的水平，提高发酵液中葡萄糖的累积浓度，对于纤维素原料的充分利用和生物转化产品产量的提高具有重大意义。很多植物病原体微生物可以合成与分泌多种纤维素酶，达到侵染植物的目的。黄单胞菌(Xanthomonas)是一种可引起植物“黑腐病”的重要的植物病菌,它能够产生并分泌多种胞外酶，如纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶和胞外多糖。同时，它具备完整的葡萄糖利用与转运系统，可有效地利用葡萄糖、甘油、果糖等多种物质作为碳源生长。已有研究证实，因其具有多个纤维素酶的编码基因并高效分泌多种纤维素酶，黄单胞菌可利用纤维素作为单一碳源生长，实现纤维素的分解。因此，本发明中我们选择了黄单胞菌为目标菌株。
发明内容
本发明的目的，就是为了降低生物转化过程中的中间产物被消耗的水平，提高发酵液中葡萄糖的累积浓度，提供一株黄单胞菌突变体及其构建方法和应用。为了实现本发明的目的，本发明采用了以下技术方案一株黄单胞菌突变体，命名为XC2460，其保藏编号为CGMCC No. 6583。上述黄单胞菌突变体的构建方法，包括以下步骤A、通过两步同源重组法敲除野生型黄单胞菌菌株Xcc 8004的XC_2460基因；B、分别使用上游引物对XC_2460-U-F/XC_2460-U-R和下游引物对XC_2460_D_F/XC_2460-D-R PCR扩增XC_2460的上游500bp片段和下游500bp片段；C、以上述两个扩增的片段为模板，利用引物对XC_2460-U-F/XC_2460-D-R通过重叠PCR方法，将这两个片段融合；D、将两个融合片段与质粒pK18mobsacB进行EcoR Ι/HindIII双酶切，回收酶切片段后，用T4DNA连接酶进行连接，获得质粒pK18mobsacB-Xc2460 ；
E、最后，借助于辅助菌株E. coli S17-1 ( λ pir)接合的方式将质粒PK18mobsacB-Xc2460转入野生型黄单胞菌菌株Xcc 8004中；首先将接合子在含10 μ g/ml卡那霉素和25 μ g/ml利福平的平板上进行一次筛选，所得阳性克隆再转入含25 μ g/ml利福平和5%蔗糖平板上进行二次筛选，得到成功敲除了 XC_2460基因的黄单胞菌突变体菌株,命名为XC2460。上述黄单胞菌突变体的构建方法，其中，所述XC2460-U-F 的序列为GTAGGAATTCgtgggtttggcgacgttggat ；XC2460-U-R 的序列为AacacgccgatcagggtcagXC_2460-D-F 的序列为GGACCAGACCCTGGCACTGACCCTGATCGGCGTGTTttaccctggatt
tctacgccaagttc ；XC2460-D-R 的序列为GTAGAAGCTTttaccagaacaccgcgtacag。上述黄单胞菌突变体在纤维素生物转化中的应用。上述黄单胞菌突变体在纤维素生物转化中的应用，是通过限制黄单胞菌的葡萄糖转运系统来提高其在纤维素生物转化过程中胞外葡萄糖的累积量，葡萄糖作为纤维素生物转化过程中的中间产物，其向胞内的转运量下降，实现了其在胞外的大量积累，提高了胞外的葡萄糖浓度，有利于后续的进一步转化。本发明以黄单胞菌Xcc 8004菌株为原始菌株，利用基因工程的方法敲除了其葡萄糖转运蛋白的编码基因XC_2460，构建了一株突变体，命名为XC2460。该XC2460菌株已于2012年9月19日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号)保藏，登记入册编号为CGMCCNo. 6583，其分类命名为野油菜黄单胞菌，拉丁名为 Xanthomonas campestrispv. campestris 。本发明中涉及的XC2460菌株的正常生理功能和代谢与野生型相比，在纤维素酶活性、胞外多糖含量及丰富培养基中的生长速度等方面没有明显差异。但是该菌株在以葡萄糖为单一碳源的培养基中生长明显比野生型缓慢，表明其葡萄糖的利用因葡萄糖转运蛋白的缺失而收到影响。然而，该XC2460菌株在水解羧甲基纤维素钠时，其胞外葡萄糖的累积浓度比野生型高出了 67%，单个细胞产生葡萄糖的量超出了野生型近5倍。·依据本发明，通过限制纤维素分解微生物的葡萄糖转运系统可显著提高其胞外葡萄糖的累积量，从而增加后续进一步转化产物的产量。因此，本发明对于提高生物转化过程的中间产物葡萄糖的浓度及后续高附加值化学物质的产量具有重大的实际意义与广阔的应用前景。
图I为突变体构建方法示意图；图2为Xcc 8004野生型和XC2460突变体的PCR鉴定结果。PCR使用的引物为 XC2460-U-F/XC2460-D-R。WT 表示野生型；Ml 表示突变体；M 表示 Takara 250bp DNAMarker。图3为野生型与突变体菌株的纤维素酶活性鉴定结果，脱色圈的大小表示纤维素酶活性的高低，WT表示野生型；M1表示突变体；图4为野生型与突变体菌株的胞外多糖产量鉴定结果，克隆大小可表示胞外多糖产量的高低，WT表示野生型；M1表示突变体；图5为野生型与突变体在丰富培养基(LB培养基)中培养时菌株的生长曲线；■表示野生型菌株Xcc 8004 ； ▲表示突变体菌株XC2460。图6为野生型与突变体在基础培养基(M63培养基含2. O %葡萄糖2g/L(NH4)2S04,13. 6g/L KH2P04，O. 2g/L MgS04，0. 5mg/LFeS04 · 7H20 和 2· 0%葡萄糖)中培养时菌株的生长曲线，■表示野生型菌株Xcc 8004 ;▲表示突变体菌株XC2460。图7为野生型与突变体的羧甲基纤维素(CMC)分解能力测定与胞外葡萄糖浓度测定曲线。使用的培养基为M63培养基(M63培养基含2. 0%葡萄糖，28/1(见14)2304，13. 6g/LKH2P04,0. 2g/LMgS04，0. 5mg/L FeS04 ·7Η20 和 0. 5% CMC)。■表示野生型菌株Xcc 8004 ；▲表示突变体菌株XC2460。所有实验重复三次取平均值。·具体实施方法下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但本发明的实施不局限于此。如无特殊说明，以下使用的材料、试剂或试剂盒均可通过商业途径购买。引物由Invitrogen公司(上海，中国)合成。PCR反应使用KOD plus聚合酶(Τ0Υ0Β0,日本)扩增。限制性内切酶与T4连接酶均购自Fermentas公司(加拿大)。质粒DNA的提取与PCR产物纯化均使用试剂盒(Qiagen，德国)。一、构建突变体菌株XC2460。通过两步同源重组法敲除野生型黄单胞菌菌株Xcc 8004的XC_2460基因。分别使用引物 XC_2460-U-F/XC_2460-U-R (XC2460-U-F =GTAGGAATTCgtgggtttggcgacgttggat ；XC2460-U-R aacacgccgatcagggtcag)和 XC_2460-D-F/XC_2460_D-R (XC2460-D-F =GGACCAGACCCTGGCACTGACCCTGATCGGCGTGTTttaccc tggatttctacgccaagttc ；XC2460-D-R GTAGAAGCTTttaccagaacaccgcgtacag), PCR 扩增 XC_2460 上游 500bp 片段(U500)和下游 500bp 片段(D500)。之后，以这两个片段为模板，利用引物对XC_2460-U-F/XC_2460-D-R通过重叠PCR方法，将这两个片段融合。将两个融合片段与质粒pK18mobSaCB质粒进行EcoR I/HindIII双酶切，回收酶切片段后用T4DNA连接酶进行连接，获得质粒pK18mObsaCB-XC2460。最后，借助与辅助菌株E. coli S17-1 ( λ pir)接合的方式将质粒pK18mobsacB-Xc2460转入野生型黄单胞菌菌株Xcc 8004中。首先将接合子在含10 μ g/ml卡那霉素和25 μ g/ml利福平的平板上进行一次筛选；阳性克隆再转入含25 μ g/ml利福平和5%蔗糖平板上进行二次筛选。二次筛选得到的克隆经PCR鉴定为成功敲除XC_2460基因的突变体菌株，命名为XC2460。基因敲除流程如图I所示，与PCR鉴定结果见图2。二、纤维素酶活性鉴定利用刚果红染色法鉴定菌株的纤维素酶活性。挑取新鲜的野生型Xcc 8004和突变体XC2460的单克隆接种于IOml LB液体培养基中，置于28°C摇床上220rpm/min培养。当生长至对数生长期时，取等量菌体用灭菌水洗涤后点于含有O. 5% CMC的固体M63培养基上(2g/L(NH4)2SO4,13. 6g/L KH2PO4,0. 2g/L MgSO4,0. 5mg/L FeS04 · 7Η20，0· 5% CMC 和 2%琼脂粉)，28°C培养48个小时。之后用I. 0%刚果红溶液染色30分钟；用IM氯化钠溶液脱色数次。观察并测定脱色圈的直径大小，结果见图3。结果显示野生型菌株与突变体菌株的纤维素酶活性无显著差异。
三、胞外多糖产量鉴定根据文献测定黄单胞菌的胞外多糖含量。挑取新鲜的野生型Xcc 8004和突变体XC2460的单克隆接种于IOml LB液体培养基中，置于28°C摇床上220rpm/min培养。当生长至对数生长期时，取等量菌体用灭菌水洗涤后点子含有2%甘油的固体LB培养基上培养72个小时。之后见光培养48小时。观察并测定克隆大小，结果见图4。结果显示野生型菌株与突变体菌株的胞外多糖产量无显著差异。四、生长曲线测定使用全自动生长曲线测试仪测定野生型Xcc 8004和突变体XC2460的生长情况。挑取新鲜的野生型Xcc 8004和突变体XC2460的单克隆接种子IOml LB液体培养基中，28°C摇床上220rpm/min培养5天，实时测定细胞的吸光度(OD6J，结果如图5、图6所示。结果显 示，在营养丰富培养基中，突变体菌株和野生型菌株的生长速度几乎一致。但在以2%葡萄糖为单一碳源的M63 基础培养基中(2g/L(NH4)2SO4,13. 6g/L KH2PO4,0. 2g/L MgSO4,0. 5mg/LFeSO4 · 7H20和2%葡萄糖)，突变体菌株XC2460的生长速度要明显落后于野生型菌株Xcc8004。这说明，突变体菌株由于其葡萄糖转运基因的敲除影响了其向胞内转运葡萄糖的量，导致其生长较野生型菌株缓慢。五、CMC分解测试与胞外葡萄糖产量测定利用氧化酶法测定葡萄糖浓度。挑取新鲜的野生型Xcc 8004和突变体XC2460的单克隆接种于 IOOOml 含有 O. 5% CMC 的 M63 基础培养基(2g/L(NH4)2S04,13. 6g/L KH2PO4,O. 2g/L MgSO4,0. 5mg/LFeS04 ·7Η20 和 0· 5% CMC)中，于 28°C摇床上 220rpm/min 培养 5 天。每12小时，取IOml培养液于12，OOOrpm离心5分钟，取上清测定葡萄糖含量。重复5次取平均值，结果见图7。结果显示，突变体菌株XC2460的胞外葡萄糖浓度比野生型菌株Xcc8004的胞外葡萄糖浓度高出了 67%。结合其生长曲线，可算出突变体菌株XC2460单个细胞产生葡萄糖的量比野生型Xcc 8004单个细胞高出了近5倍。因此，通过限制纤维素分解微生物的葡萄糖转运系统可显著提高其胞外葡萄糖的累积量，从而增加后续进一步转化产物的产量。
权利要求
1.一株黄单胞菌突变体，命名为XC2460，其保藏编号为CGMCC No. 6583。
2.根据权利要求I所述的黄单胞菌突变体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤 A、通过两步同源重组法敲除野生型黄单胞菌菌株Xcc8004的XC_2460基因； B、分别使用上游引物对XC_2460-U-F/XC_2460-U-R和下游引物对XC_2460_D_F/XC_2460-D-R PCR扩增XC_2460的上游500bp片段和下游500bp片段； C、以上述两个扩增的片段为模板，利用引物对XC_2460-U-F/XC_2460-D-R通过重叠PCR方法，将这两个片段融合； D、将两个融合片段与质粒pK18mobSaCB进行EcoRΙ/HindIII双酶切，回收酶切片段后，用T4DNA连接酶进行连接，获得质粒pK18mobsacB-Xc2460 ； E、最后，借助于辅助菌株E.coli S17-1 (λ pir)接合的方式将质粒PK18mobsacB-Xc2460转入野生型黄单胞菌菌株Xcc 8004中；首先将接合子在含10 μ g/ml卡那霉素和25 μ g/ml利福平的平板上进行一次筛选，所得阳性克隆再转入含25 μ g/ml利福平和5%蔗糖平板上进行二次筛选，得到成功敲除了 XC_2460基因的黄单胞菌突变体菌株,命名为XC2460。
3.根据权利要求2所述的黄单胞菌突变体的构建方法，其特征在于所述XC2460-U-F的序列为GTAGGAATTCgtgggtttggcgacgttggat ； XC2460-U-R 的序列为Aacacgccgatcagggtcag ； XC_2460-D~F的序列为GGACCAGACCCTGGCACTGACCCTGATCGGCGTGTTttaccctggatttctacgccaagttc ； XC2460-D-R 的序列为GTAGAAGCTTttaccagaacaccgcgtacag。
4.根据权利要求I所述的黄单胞菌突变体在纤维素生物转化中的应用。
5.根据权利要求4所述的黄单胞菌突变体在纤维素生物转化中的应用，其特征在于通过限制黄单胞菌的葡萄糖转运系统来提高其在纤维素生物转化过程中胞外葡萄糖的累积量，葡萄糖作为纤维素生物转化过程中的中间产物，其向胞内的转运量下降，实现了其在胞外的大量积累，提高了胞外的葡萄糖浓度，有利于后续的进一步转化。
全文摘要
本发明提供了一株黄单胞菌突变体及其构建方法和应用。本发明通过敲除葡萄糖转运基因，限制葡萄糖的胞内转运系统来改善葡萄糖胞外的累积量。以植物病原微生物黄单胞菌为目标菌株，敲除其主要的葡萄糖转运基因，构建了一株突变体，命名为XC2460，其保藏编号为CGMCC No.6583。在营养丰富的培养基中，突变体与野生型在性状方面没有差异；但在以葡萄糖为单一碳源的培养基中，突变体生长明显比野生型缓慢。同时，在水解羧甲基纤维素时，突变体的胞外葡萄糖累积浓度比野生型高出了67％，单个细胞产生葡萄糖的量比野生型细胞高出近5倍。本发明对提高纤维素生物转化过程中葡萄糖的累积量具有重大的意义和广阔的应用前景。
文档编号C12R1/64GK102925399SQ20121040731
公开日2013年2月13日 申请日期2012年10月23日 优先权日2012年10月23日
发明者梁如冰, 马辰, 刘建华 申请人:上海交通大学