专利名称：抗黑腐病花椰菜品种早期筛查试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术中的分子标记辅助早期筛查抗黑腐病花椰菜新品种的试剂盒及其利 用该试剂盒进行检测的方法。
背景技术：
花椰菜黑腐病是由黄单胞杆菌属甘蓝黑腐黄单胞菌甘蓝黑腐致病变种[ZaW/jo/m)w^ ca/ ^e欲!;ypv. cflw; e欲W Pam.) Dowson]侵入所致，属于世界性的重要细菌性病害。花椰菜黑 腐病主要危害叶片或花球。幼苗受害时，子叶染病呈水渍状，逐渐变褐枯死；真叶染病，病菌 由水孔侵入的引起叶缘发病，呈V字形病斑。成株期发病，病菌从叶缘水孔和伤口侵入，除叶 缘形成向内扩展的V字形枯斑外，病菌沿叶脉向下扩展,形成较大坏死区或不规则黄褐色大 斑，病斑边缘叶片组织淡黄色。该病流行时，叶缘多处受侵，造成外叶局部或全部腐烂，使叶 片失去管和作用功能。病斑干枯或形成穿孔后，病菌进入茎部维管束后，在茎部逐渐蔓延，可 及叶柄与叶脉处，引起植株萎蔫。花球受害时，病菌先从花梗侵入，颜色变成灰黑色，并逐渐 蔓延到花球，呈灰黑色干腐状。最后植株全部死亡。
近年来，菜田复种指数普遍提高，加之生态条件改变和境外大量引种及广泛种植,又随着 连作年限时间的延长，花椰菜黑腐病植株发病率越来越高，危害日趋严重，且黑腐病危害期长， 在花椰菜的整个生长期均可发生，该病大流行使蔬菜的产量和品质急剧下降，给生产造成巨 大损失。严重年份发病率高达60% 80%,直接影响花椰菜的产量和品质，给花椰菜的生产造 成极大危害和经济损失。
我国十分重视花椰菜的抗黑腐病育种，通过常规育种，与抗病品种杂交和多代自交，选 育出一批具有高抗和中抗的花椰菜品种，在生产上发挥了重要的作用，但由于选育周期较长， 而且还消耗了大量的土地、人力和物力，所筛选出的品种远远不能满足生产上的需要。因此， 依托生物技术，充分利用DNA分子标记遗传稳定性高，不受取材部位、时间、发育时期和环 境的影响，操作简单、耗时少的优势，建立能在苗期就可对花椰菜抗、感黑腐病性状进行大 规模筛查的方法，对抗黑腐病花椰菜新品种的选育具有重要意义。
有关花椰菜黑腐病的研究国内外报道很少，利用分子标记辅助花椰菜进行抗病育种方面 的研究未见报道。利用特异分子标记进行早期筛选的关键是筛选到与抗病相关的特异标记。
发明内容
本发明的目的是克服常规抗黑腐病花椰菜选种技术的不足，提供一种快速、早期、大规 模筛选抗黑腐病花椰菜新品种或单株的试剂盒及其利用该试剂盒进行检测的方法。
3本发明的技术方案概述如下
抗黑腐病花椰菜品种早期筛査试剂盒，它是由特异引物1 : TACTGGTGGCTGTAGATTATGT和特异引物2: AATGGCAAGGGTTCAAGGGTAGG; dNTP、 Taq聚合酶、PCR缓冲液、DNA模板、无菌去离子水、6x上样缓冲液及标准阳性Marker组 成。
一种使用上述试剂盒在苗期对抗黑腐病花椰菜品种进行筛査的方法，它包括如下步骤 (l)一步法提取花椰菜基因组DNA; (2)基因组DNA的0.8%琼脂糖凝胶电泳检测；(3) PCR扩增在PCR扩增专用的薄壁离心管中加入PCR缓冲溶液、dNTP、特异引物l、特 异引物2、花椰菜基因组DNA、 Taq聚合酶、无菌水补至25微升，将装有上述液体的PCR 专用薄壁离心管放入PCR扩增仪中，扩增条件为94'C变性180秒，后进行94。C变性30秒， 52'C退火45秒，72'C延伸120秒的扩增循环，循环数为35个，最后在72'C延伸480秒，扩 增完成。(4) PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测配置1.2%的琼脂糖凝胶，在凝胶中加入 溴化乙锭(0.5微克/毫升)；在5微升扩增产物及5微升标准阳性Marker中分别加入1微升6x 上样缓冲液，混匀，用移液器将上述混合液分别加入浸没0.5xTBE电泳液的琼脂糖凝胶的点 样孔中，80V恒电压，电泳1800秒后停止电泳。凝胶直接在紫外灯下(紫外波长265nm)或 在凝胶成像仪器上进行观察；(5)依照标准阳性Marker带在凝胶上的迁移位置和PCR产物 的迁移位置判断未知花椰菜抗、感黑腐病情况。
利用该技术的检测结果与田间的吻合率达％%，而且具有简便、快速、准确，不受生长 季节、环境条件等影响的特点，再定苗移栽前即可检测，节省了大量土地、人力和物力，縮 短了选种的时间，在花椰菜抗病育种上具有重要的应用价值。
图l是花椰菜已知抗、感黑腐病的电泳检测结果 图2是未知抗病性花椰菜田间随机检测的电泳检测结果
具体实施例方式
下面结合实施例子和附图对本发明做进一步的说明 实施例1
利用已知抗黑腐病和感黑腐病花椰菜植株进行检测方法，包括以下步骤
(1)提取抗、感黑腐病花椰菜基因组DNA: 取幼嫩花椰菜叶片100mg，用剪刀将其剪碎 置于组织研磨器中，加入100pL提取缓冲溶液(1%SDS， 10mmol/L Tris,0.3mol/L EDTA，l%PVPP,pH8.0)，充分研磨成匀浆，然后加入400pL提取缓冲溶液，混匀后置9(TC水 浴中温育20分钟，期间要不时的颠倒摇匀，取出后置于冰浴中5分钟，4'C保存备用。(2)DNA浓度的测定可采用两种方法进行， 一是利用紫外分光光度计测量，二是利用自制的已
知标准的凝胶平板测量， 一般的浓度要求在200ng以上/pL即可。(3) PCR扩增在PCR 扩增专用的薄壁离心管中加入10xPCR缓冲溶液2.5pL、 10mmol/LdNTP0.5nL 、 10^irnol/L 特异引物1和2各lpL、花椰菜基因组DNA400ng、 T叫聚合酶2单位、无菌水补至25pL， 将装有上述液体的PCR专用薄壁离心管放入PCR扩增仪中，扩增条件为94'C变性180秒， 后进行94'C变性30秒，52'C退火45秒，72'C延伸120秒的扩增循环，循环数为35个，最 后在72。C延伸480秒，扩增完成。(4) PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测配置1.2%的 琼脂糖凝胶，在凝胶中加入溴化乙锭(0.5微克/毫升)；在5微升扩增产物及5微升标准阳性 Marker中分别加入1微升6x上样缓冲液，混匀，用移液器将上述混合液分别加入浸没0.5xTBE 电泳液的琼脂糖凝胶的点样孔中，80V恒电压，电泳1800秒后停止电泳。凝胶直接在紫外 灯下(紫外波长265nm)或在凝胶成像仪器上进行观察；(5)依照标准阳性Marker带在凝胶 上的迁移位置和PCR产物的迁移位置判断花椰菜抗、感黑腐病情况。如图1所示泳道1.-10 为已知抗黑腐病的花椰菜植株；11-20是己知感病的花椰菜植株，21为试剂盒提供的标准阳 性Marker为1700bp，图2是田间随机取材检测的结果，随机取样的单株随后进行大田抗黑 腐病性状观察大田观察结果证实，有1700bp带的是抗黑腐病的花椰菜植株，无1700bp带 的是感病的花椰菜植株。
权利要求
1. 抗黑腐病花椰菜品种早期筛查试剂盒，其特征在于它由特异引物1、特异引物2、dNTP、Taq聚合酶、PCR缓冲液、DNA模板、无菌去离子水、6×上样缓冲液及标准阳性Marker组成。
2. —种使用权利要求1的在苗期对抗黑腐病花椰菜品种进行筛査的方法，其特征是它包括如下步骤(1) 一步法提取花椰菜基因组DNA; (2)基因组DNA的0.8%琼脂糖凝胶电泳检测；(3) PCR扩增在PCR扩增专用的薄壁离心管中加入PCR缓冲溶液、dNTP、特异引物l、特 异引物2、花椰菜基因组DNA、 Taq聚合酶、无菌水补至25微升，将装有上述液体的PCR 专用薄壁离心管放入PCR扩增仪中，扩增条件为94'C变性180秒，后进行94'C变性30秒， 52。C退火45秒，72X:延伸120秒的扩增循环，循环数为35个，最后在72'C延伸480秒，扩 增完成。(4) PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测配置1.2°/。的琼脂糖凝胶，在凝胶中加入 溴化乙锭(0.5微克/毫升)；在5微升扩增产物及5微升标准阳性Marker中分别加入1微升6x 上样缓冲液，混匀，用移液器将上述混合液分别加入浸没0.5xTBE电泳液的琼脂糖凝胶的点 样孔中，80V恒电压，电泳1800秒后停止电泳。凝胶直接在紫外灯下(紫外波长265nm) 或在凝胶成像仪器上进行观察；(5)依照标准阳性Marker条带在凝胶上的迁移位置和PCR 产物的迁移位置判断未知花椰菜抗、感黑腐病情况。
全文摘要
本发明公开了一个对花椰菜抗黑腐病新品种进行早期筛查的试剂盒和使用该试剂盒的检测方法。试剂盒由dNTP、Taq聚合酶、PCR缓冲液、DNA模板、无菌去离子水、6×上样缓冲液及标准阳性Marker组成。检测方法包括以下步骤(1)花椰菜基因组DNA的一步法提取；(2)基因组DNA提取结果的琼脂糖凝胶电泳检测；(3)PCR扩增；(4)PCR扩增产物凝胶电泳检测；(5)结果判读依照标准阳性Marker带在凝胶上的迁移位置和PCR产物的迁移位置判断未知花椰菜抗、感黑腐病情况。利用该试剂盒筛查鉴定抗黑腐病花椰菜新品种或株系的结果与田间抗病性状吻和率达96％以上。该试剂盒检测具有简便、快速、准确，不受生长季节、环境条件等因素的影响，且可在苗期就能完成筛查、鉴定，节省了大量土地、人力、物力，并大大缩短了选种时间，在花椰菜抗黑腐病育种上具有重要的应用价值。
文档编号C12Q1/68GK101423868SQ20081015401
公开日2009年5月6日 申请日期2008年12月12日 优先权日2008年12月12日
发明者瑜 古, 孙德岭, 宋文芹, 王春国, 擘 郝, 陈成彬 申请人:南开大学