专利名称：一种ems诱变花椰菜小孢子获得抗寒dh突变体的方法
技术领域：
本发明属于植物细胞工程技术领域，具体涉及一种EMS诱变花椰菜小孢子获得抗寒 DH (双单倍体)突变体的方法。
背景技术：
花椰菜由于其营养丰富、质地柔嫩、味道鲜美深受广大消费者的喜爱。近年来栽培面 积和消费量增长迅速，目前花椰菜己成为国内外蔬菜市场的重要蔬菜种类之一。我国不仅 是世界上花椰菜种植面积最大、总产量最高，而且也是种植面积增长最快的国家，但我国 花椰菜平均单产在世界上仅居第23位。我国远离花椰菜起源中心，资源匮乏在很大程度上 限制了我国花椰菜育种研究水平的提高。因此利用高新育种技术，创造优异的花椰菜种质 资源，拓宽我国花椰菜种质资源遗传背景，选育出多样性的花椰菜系列优良品种尤为重要。
遗传育种单位和科学家，纷纷把种质资源创新作为育种工作的核心，探索先进、高效 的种质资源创新技术，在短时间内创造大量的优异育种材料一直是植物遗传育种家努力求 索的目标。游离小孢子培养技术的出现使植物育种学家多年的梦想成为现实。随着游离小 孢子培养技术的日益成熟，诱变技术与游离小孢子培养技术相结合，是近年来新兴的一项
很有应用前景的研究项目。诱变技术与游离小孢子培养技术相结合有许多优点游离小孢
子数量大、体积小(20pm)、诱变剂容易吸收；突变类型丰富，提高了变异频率和扩大了 变异谱；隐性基因能于DH (双单倍体)植株直接表达，Mi世代就可以进行性状选择，縮 短育种时间；筛选程序易于操作，提高选择效率。目前使用的诱变剂主要分为物理诱变剂 和化学诱变剂两类，化学诱变剂中EMS(甲基磺酸乙酯)的应用最为广泛，效果最好。与其 他诱变剂相比，EMS诱变后产生的突变频率高，且多为显性突变体，易于进行突变体的筛 选。EMS诱导突变的原理是使G不再与C配对而与T配对，从而造成G : C-A : T转换， 造成点突变。目前这种诱变剂已被广泛应用于农作物诱变育种当中，现已育成2,250个品 种。
Swanson (1989)用乙基亚硝基脉诱导甘蓝型油菜小孢子，分别获得耐Chlrosulfuron (CS， 一种除草齐IJ)株"M-37"和"P-26"，其自交后代仍保持较高水平的CS耐性，比对 照品种高10-1000倍；Barro(2001)用EMS诱变埃塞俄比亚芥小孢子，使芥酸含量发生了 广泛变异；和江明(2003 )用EMS诱变甘蓝型油菜小孢子获得高油酸突变体。陆柳英(2007) 以EMS为诱变剂获得了木薯抗寒突变体。
花椰菜属于喜温性蔬菜，抗寒能力较弱，培育抗寒能力强的花椰菜新品种，可以推迟 花椰菜的采收时间，实现花椰菜的周年供应。本研究利用花椰菜游离小孢子为试验材料， 利用EMS诱变剂进行诱变，筛选抗寒性突变体，为花椰菜种质资源创新和抗寒性新品种选 育提供物质基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种EMS诱变花椰菜小孢子获得抗寒DH突变体的方法。本发明的技术方案概述如下-
一种EMS诱变花椰菜小孢子获得抗寒DH突变体的方法，包括如下步骤-
(1) 分离和纯化花椰菜游离小孢子
选取长度为2.5mm 3.0mm花椰菜花蕾，水冲洗20 40 min，用体积百分浓度为60% 80%的乙醇水溶液消毒20 40 sec，再用质量百分浓度为0.1 % HgCl2水溶液灭菌8 10min， 无菌水洗涤3 4次，沥干水分后，加入所述花椰菜花蕾质量2 4倍的改良B5培养基，碾 压10 20sec，过50nm的筛，收集滤液，在700 1500 rpm下离心2 3 min， 弃上清液， 按lg与2.5 10ml的比例，向沉淀物中加入改良B5培养基，400 700 rpm下离心2 5 min， 再按lg与2.5 10ml的比例，向沉淀物中加入改良B5培养基，400 700rpm下离心2 5 min，弃上清液，沉淀物即为纯净花椰菜游离小孢子；
(2) 花椰菜游离小孢子诱变-
将所述花椰菜游离小孢子添加到改良NLN培养基中，再加入曱基磺酸乙酯，使甲基磺 酸乙酯在所述改良NLN培养基中的质量百分浓度为0. 25% 0. 5 %，在30 34'C暗处理4 10h， 800 1200 rpm，离心2 4min，用改良NLN培养基洗涤2 4次，弃上清，所述甲基 磺酸乙酯简写为EMS;
(3) 秋水仙素进行花椰菜小孢子加倍
将经步骤(2)处理的花椰菜游离小孢子悬浮在添加有秋水仙碱的改良NLN培养基中， 使花椰菜游离小孢子浓度为lX106 2Xl()6个/m1, 30 34。C暗培养10 12h，进行小孢子 加倍，所述秋水仙碱在所述改良NLN培养基中的浓度为200 500mg/L;
(4) 加倍花椰菜游离小孢子培养和胚诱导-
将经歩骤(3)处理的加倍花椰菜游离小孢子离心弃上清，放入添加有活性炭的改良 NLN培养基中进行悬浮培养，使加倍花椰菜游离小孢子浓度为IX 105 2X 1(f个/ml,密封 后置于25 32'C暗培养16 30h,移至20 30'C黑暗条件下静止培养，当肉眼可见胚状 体时，转移至20 30°C， 30 70rpm振荡暗培养，当胚状体3 4mm时停止震荡，将获 得的胚状体转移至5000 100001x，16h (!—i光照下进行培养，胚转绿后转移至MS培养基中 诱导不定芽的形成，培养至真叶形成时，转移至MS培养基上生根，当植株幼苗真叶完全 展开时，进行抗寒性筛选，所述活性炭在改良NLN培养基中的浓度为250-600mg/L;
(5) 抗寒性筛选-
在3'C， 72h条件筛选出花椰菜抗寒DH突变体。 .
所述改良B5培养基的组份为NaH2P04'H20 150mg/L ， KN03 2500 mg/L， CaCl2.2H20 150mg/L， MgS04'7H20 250 mg/L， (NH4)2S04 130 mg/L， KI 0.9 mg/L, H3B04 3.0 mg/L， MnS04.4H20 10 mg/L， ZnS04'7H20 2.0 mg/L， Na2Mo04.2H20 0.25 mg/L， CoCL2'6H20 0.025 mg/L， CuS04'5H20 0.025 mg/L， Na2-EDTA40 mg/L， FeS04.7H20 27.8 mg/L，肌醇100 mg/L， 烟酸1.0mg/L，盐酸吡哆醇1.0mg/L，盐酸硫铵10mg/L， 110mg/L蔗糖，余量为水。
所述改良NLN培养基的组份为KN03 1 25mg / L， MgS04 7H20 125mg / L， KH2P04 125rag / L， Ca ( N 03 )24H20 500mg / L， Na2 EDTA 37 , 3mg / L， FeS04 . 7H20 0. 3mg/ L ， MnS04 . 4H20 25mg / L ， KI 8. 3mg / L ， H3B03 10mg / L ， ZnS044H20 10mg / L , Na2 Mo04 2H20 0 . 25rag / L ， CoCI26H20 0. 025mg / L ， CuS045H20 0 025mg / L ，肌醇lOOmg / L ，烟酸5.0mg / L，维生素B!O . 5mg / L,维生素B60 . 5mg/L， 叶酸0 . 5mg/L，生物素0 . 05mg/ L ，甘氨酸2. Omg/L，谷胱甘肽30mg/L，谷氨酞胺600mg / L ，丝氨酸lOOmg / L脯氨酸200mg/L;蔗糖130mg / L，余量为水。
本发明的优点
1本发明利用EMS诱变花椰菜小孢子获得抗寒性突变体，丰富了花椰菜育种资源； 2本发明建立的花椰菜游离小孢子诱变和抗寒突变体筛选技术，可以明显縮短获得新 种质资源的年限；
3本发明建立的花椰菜游离小孢子诱变和抗寒突变体筛选技术，同样适用于十字花科 其他蔬菜的小孢子诱变和抗寒性突变体筛选；
4通过添加诱变剂EMS，可以明显提高小孢子突变频率和突变谱；
5为培育花椰菜抗寒新品种提供物质基础。
图1为加倍花椰菜游离小孢子培养获得的胚状体。 图2用本发明的方法获得的抗寒DH突变体的植株。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明 实施例1
(1) 分离和纯化花椰菜游离小孢子
选取长度为2.5mm 3.0mm花椰菜花蕾，此时小孢子多数处于单核靠边期，水冲洗30 min，用体积百分浓度为70。/。的乙醇水溶液消毒30sec，再用质量百分浓度为0.1 % HgCl2 水溶液灭菌8min ，无菌水洗涤3次，沥干水分后，加入所述花椰菜花蕾质量3倍的改良 Bs培养基，在研钵中用玻棒碾压10sec挤出小孢子，过5(Him的筛，收集滤液，在1000rpm 下离心3min，弃上清液，按lg与5ml的比例，向沉淀物中加入改良B5培养基，500 rpm 下离心3 min，再按lg与5ml的比例，向沉淀物中加入改良B5培养基，500 rpm下离心3min， 弃上清液，沉淀物即为纯净花椰菜游离小孢子；
(2) 花椰菜游离小孢子诱变
将步骤(1)制备的花椰菜游离小孢子添加到改良NLN培养基中，再加入甲基磺酸乙 酯(简写为EMS)，使甲基磺酸乙酯在所述改良NLN培养基中的质量百分浓度为0.35。/D，在 32。C暗处理8h， 1000 rpm，离心3min,用改良NLN培养基洗涤3次，弃上清；
(3) 秋水仙素进行花椰菜小孢子加倍
将经步骤(2)处理的花椰菜游离小孢子悬浮在添加有秋水仙碱的改良NLN培养基中， 使花椰菜游离小孢子浓度为1.5Xl()6个/ml，32T:暗培养llh,进行小孢子加倍，所述秋水仙 碱在所述改良NLN培养基中的浓度为300mg/L;
(4) 加倍花椰菜游离小孢子培养和胚诱导将经步骤(3)处理的加倍花椰菜游离小孢子离心弃上清，放入添加有活性炭的改良 NLN培养基中进行悬浮培养，使加倍花椰菜游离小孢子浓度为1.5Xl()5个/nil，密封后置于 3(TC暗培养24h，移至25'C黑暗条件下静止培养，当肉眼可见胚状体时，转移至25'C， 50 rpm振荡暗培养，当胚状体3 4mm时停止震荡，将获得的胚状体转移至8000bc,16h d—1 光照下进行培养，胚转绿后转移至MS培养基中诱导不定芽的形成，培养至真叶形成时， 转移至MS培养基上生根，当植株幼苗真叶完全展开时，进行抗寒性筛选，所述活性炭在 改良NLN培养基中的浓度为400mg/L; (5)抗寒性筛选
在3 °C ， 72h条件筛选出花椰菜抗寒DH突变体。
实施例2
(1) 分离和纯化花椰菜游离小孢子
选取长度为2.5mm 3.0mm花椰菜花蕾，此时小孢子多数处于单核靠边期，水冲洗20 min，用体积百分浓度为80%的乙醇水溶液消毒20sec，再用质量百分浓度为0.1 % HgCl2 水溶液灭菌9min，无菌水洗涤4次，沥干水分后，加入所述花椰菜花蕾质量2倍的改良 Bs培养基，在研钵中用玻棒碾压15sec挤出小孢子，过50pm的筛，收集滤液，在700rpm 下离心3min，弃上清液，按lg与2.5ml的比例，向沉淀物中加入改良B5培养基，400rpm 下离心5 min，再按lg与2.5ml的比例，向沉淀物中加入改良B5培养基，400 rpm下离心 5min，弃上清液，沉淀物即为纯净花椰菜游离小孢子；
(2) 将步骤(1)制备的花椰菜游离小孢子添加到改良NLN培养基中，再加入甲基磺 酸乙酯，使甲基磺酸乙酯在所述改良NLN培养基中的质量百分浓度为0. 25%，在3(TC暗处 理10h， 800 rpm，离心4min，用改良NLN培养基洗涤4次，弃上清；
(3) 秋水仙素进行花椰菜小孢子加倍
将经步骤(2)处理的花椰菜游离小孢子悬浮在添加有秋水仙碱的改良NLN培养基中， 使花椰菜游离小孢子浓度为1Xl()6个/nil,3(rC暗培养12h，进行小孢子加倍，所述秋水仙 碱在所述改良NLN培养基中的浓度为200mg/L;
(4) 加倍花椰菜游离小孢子培养和胚诱导
将经步骤(3)处理的加倍花椰菜游离小孢子离心弃上清，放入添加有活性炭的改良 NLN培养基中进行悬浮培养，使加倍花椰菜游离小孢子浓度为1X K)5个/ml，密封后置于32 'C暗培养16h，移至30 'C黑暗条件下静止培养，当肉眼可见胚状体时，转移至3(TC，30rpm 振荡暗培养，当胚状体3 4mm时停止震荡，将获得的胚状体转移至50001x,16h cT1光照 下进行培养，胚转绿后转移至MS培养基中诱导不定芽的形成，培养至真叶形成时，转移 至MS培养基上生根，当植株幼苗真叶完全展开时，进行抗寒性筛选，所述活性炭在改良 NLN培养基中的浓度为600mg/L;
(5) 抗寒性筛选
在3t:， 72h条件筛选出花椰菜抗寒DH突变体。 实施例3(1) 分离和纯化花椰菜游离小孢子 选取长度为2.5mm 3.0mm花椰菜花蕾，此时小孢子多数处于单核靠边期，水冲洗40
min，用体积百分浓度为60%的乙醇水溶液消毒40 sec，再用质量百分浓度为0.1 % HgCl2 水溶液灭菌10min,无菌水洗涤3次，沥干水分后，加入所述花椰菜花蕾质量4倍的改良 Bs培养基，在研钵中用玻棒碾压20sec挤出小孢子，过5(Hmi的筛，收集滤液，在1500rpm 下离心2min，弃上清液，按lg与10ml的比例，向沉淀物中加入改良B5培养基，700 rpm 下离心2 min，再按lg与10ml的比例，向沉淀物中加入改良B5培养基，700 rpm下离心 2min，弃上清液，沉淀物即为纯净花椰菜游离小孢子；
(2) 花椰菜游离小孢子诱变
将步骤(1)制备的花椰菜游离小孢子添加到改良NLN培养基中，再加入甲基磺酸乙 酯，使甲基磺酸乙酯在所述改良NLN培养基中的质量百分浓度为0.5y。，在34'C暗处理4h， 1200 rpm，离心2min，用改良NLN培养基洗涤2次，弃上清，所述甲.基磺酸乙酯简写为EMS;
(3) 秋水仙素进行花椰菜小孢子加倍
将经步骤(2)处理的花椰菜游离小孢子悬浮在添加有秋水仙碱的改良NLN培养基中， 使花椰菜游离小孢子浓度为2Xl()6个/ml，34t:暗培养10h，进行小孢子加倍，所述秋水仙 碱在所述改良NLN培养基中的浓度为500mg/L;
(4) 加倍花椰菜游离小孢子培养和胚诱导
将经步骤(3)处理的加倍花椰菜游离小孢子离心弃上清，放入添加有活性炭的改良 NLN培养基中进行悬浮培养，使加倍花椰菜游离小孢子浓度为2X 1(f个/ml，密封后置于25 'C暗培养30h，移至2(TC黑暗条件下静止培养，当肉眼可见胚状体时，转移至2(TC， 70 rpm振荡暗培养，当胚状体3 4mm时停止震荡，将获得的胚状体转移至10000k,16h d—1 光照下进行培养，胚转绿后转移至MS培养基中诱导不定芽的形成，培养至真叶形成时， 转移至MS培养基上生根，当植株幼苗真叶完全展开时，进行抗寒性筛选，所述活性炭在 改良NLN培养基中的浓度为250mg/L;
(5) 抗寒性筛选
在3i:， 72h条件筛选出花椰菜抗寒DH突变体。 抗寒性筛选和游离脯氨酸含量测定
依据花椰菜在低于5"C气候条件下受冻害的特点，以3'C， 72d低温条件筛选经诱变剂 处理而获得的DH植株，共筛选出4份抗寒DH突变体。对筛选到的DH抗寒突变植株采 用酸性茚三酮法测定游离脯氨酸含量，实验结果发现，突变体游离脯氨酸的含量介于 20-33%之间，
与不抗寒花椰菜资源游离脯氨酸含量差异显著。
实施例4
改良B5培养基的组份为NaH2P04'H20 150mg/L ， KN03 2500 mg/L， CaCl2'2H20 150 mg/L， MgS047H20 250 mg/L， (NH4)2S04 130 mg/L, KI 0.9 mg/L， H3B04 3.0 mg/L， MnS04.4H20 10 mg/L, ZnS04.7H20 2.0 mg/L， Na2Mo04.2H20 0.25 mg/L， CoCL26H20 0.025mg/L， CuS04.5H20 0.025 mg/L， Na2-EDTA40 mg/L， FeS04-7H20 27.8 mg/L，肌醇100 mg/L， 烟酸1.0mg/L，盐酸吡哆醇1.0mg/L，盐酸硫铵10mg/L， 110mg/L蔗糖，余量为水。
实施例5
改良NLN培养基的组份为KN03 1 25mg / L， MgS04 7H力125mg / L， KH2P04 125呢 / L， Ca ( N 03 )2 4H20 5 00mg / L， Na2 EDTA 37 . 3mg / L, FeS04 . 7H20 0. 3mg / L ， MnS04 . 4H20 25mg / L , KI 8. 3mg / L , H3B03 10mg / L , ZnS04 4H20 10mg / L , Na2 Mo04 2H20 0 . 25mg / L ， CoCI2 6H20 0 . 02 5mg / L ， CuS04 5H20 0 . 02 5mg / L ， 肌醇lOOmg / L ，烟酸5. Omg / L，维生素B,O . 5mg / L，维生素B60 . 5mg/L，叶酸0 . 5呢/L，生物素0 05mg/ L ，甘氨酸2. Omg/L，谷胱甘肽30mg/L，谷氨酞胺600mg / L ， 丝氨酸lOOmg / L脯氨酸200mg/L;蔗糖130mg / L，余量为水。
权利要求
1. 一种EMS诱变花椰菜小孢子获得抗寒DH突变体的方法，其特征是包括如下步骤(1)分离和纯化花椰菜游离小孢子选取长度为2. 5mm～3.0mm花椰菜花蕾，水冲洗20～40min，用体积百分浓度为60％～80％的乙醇水溶液消毒20～40sec，再用质量百分浓度为0.1％HgCl2水溶液灭菌8～10min，无菌水洗涤3～4次，沥干水分后，加入所述花椰菜花蕾质量2～4倍的改良B5培养基，碾压10～20sec，过50μm的筛，收集滤液，在700～1500rpm下离心2～3min，弃上清液，按1g与2.5～10ml的比例，向沉淀物中加入改良B5培养基，400～700rpm下离心2～5min，再按1g与2.5～10ml的比例，向沉淀物中加入改良B5培养基，400～700rpm下离心2～5min，弃上清液，沉淀物即为纯净花椰菜游离小孢子；(2)花椰菜游离小孢子诱变将所述花椰菜游离小孢子添加到改良NLN培养基中，再加入甲基磺酸乙酯，使甲基磺酸乙酯在所述改良NLN培养基中的质量百分浓度为0.25％～0.5％，在30～34℃暗处理4～10h，800～1200rpm，离心2～4min，用改良NLN培养基洗涤2～4次，弃上清，所述甲基磺酸乙酯简写为EMS；(3)秋水仙素进行花椰菜小孢子加倍将经步骤(2)处理的花椰菜游离小孢子悬浮在添加有秋水仙碱的改良NLN培养基中，使花椰菜游离小孢子浓度为1×106～2×106个/ml，30～34℃暗培养10～12h，进行小孢子加倍，所述秋水仙碱在所述改良NLN培养基中的浓度为200～500mg/L；(4)加倍花椰菜游离小孢子培养和胚诱导将经步骤(3)处理的加倍花椰菜游离小孢子离心弃上清，放入添加有活性炭的改良NLN培养基中进行悬浮培养，使加倍花椰菜游离小孢子浓度为1×105～2×105个/ml，密封后置于25～32℃暗培养16～30h，移至20～30℃黑暗条件下静止培养，当肉眼可见胚状体时，转移至20～30℃，30～70rpm振荡暗培养，当胚状体3～4mm时停止震荡，将获得的胚状体转移至5000～100001x，16h·d-1光照下进行培养，胚转绿后转移至MS培养基中诱导不定芽的形成，培养至真叶形成时，转移至MS培养基上生根，当植株幼苗真叶完全展开时，进行抗寒性筛选，所述活性炭在改良NLN培养基中的浓度为250-600mg/L；(5)抗寒性筛选在3℃，72h条件筛选出花椰菜抗寒DH突变体。
2. 根据权利要求1所述的一种EMS诱变花椰菜小孢子获得抗寒DH突变体的方法，其特征 是所述改良B5培养基的组份为NaH2P(VH20 150mg/L ，KN03 2500mg/L，CaClr2H20 150 mg/L， MgS04.7H20 250 mg/L, (NH4)2S。4 130 mg/L, KI 0.9 mg/L， H3B04 3.0 mg/L， MnS04'4H20 10 mg/L， ZnS04'7H20 2.0 mg/L， Na2Mo04'2H20 0.25 mg/L， CoCL2'6H20 0.025 mg/L， CuS04'5H20 0.025 mg/L， Na2-EDTA40 mg/L， FeS04'7H20 27.8 mg/L，肌醇100 mg/L， 烟酸1.0mg/L，盐酸吡哆醇1.0mg/L，盐酸硫铵10mg/L， 110mg/L蔗糖，余量为水。
3. 根据权利要求1所述的一种EMS诱变花椰菜小孢子获得抗寒DH突变体的方法，其特征 是所述改良NLN培养基的组份为KN03 1 25mg/L， MgS04 , 7H20 125mg/L， KH2PCU25mg / L， Ca ( N 03 )2 4H20 5 00mg / L， Na2 EDTA 37 . 3mg / L， FeS04 . 7H20 0. 3mg / L ，MnS04 . 4H20 25mg / L , KI 8. 3mg / L , H3B03 10mg / L ， ZnS04 4H20 10mg / L , Na2 Mo04 2H20 0 . 25mg / L ， CoCI2 6H20 0. 02 5mg / L , CuS04 5H20 0 025mg / L ， 肌醇lOOmg / L ，烟酸5. Omg / L ，维生素. 5mg / L ，维生素B60 . 5mg/L，叶 酸0 . 5mg/L，生物素0 . 05mg/ L ，甘氨酸2. Omg/L，谷胱甘肽30mg/L，谷氨酞胺600mg / L ，丝氨酸lOOmg / L脯氨酸200mg/L;蔗糖130mg / L，余量为水。
全文摘要
本发明公开了一种EMS诱变花椰菜小孢子获得抗寒DH突变体的方法，包括如下步骤(1)分离和纯化花椰菜游离小孢子；(2)花椰菜游离小孢子诱变；(3)秋水仙素进行花椰菜小孢子加倍；(4)加倍花椰菜游离小孢子培养和胚诱导；(5)抗寒性筛选；本发明利用EMS诱变花椰菜小孢子获得抗寒性突变体，丰富了花椰菜育种资源；建立的花椰菜游离小孢子诱变和抗寒突变体筛选技术，可以明显缩短获得新种质资源的年限；本发明同样适用于十字花科其他蔬菜的小孢子诱变和抗寒性突变体筛选；通过添加诱变剂EMS，可以明显提高小孢子突变频率和突变谱；为培育花椰菜抗寒新品种提供物质基础。
文档编号A01H1/06GK101449657SQ20081015470
公开日2009年6月10日 申请日期2008年12月30日 优先权日2008年12月30日
发明者佟志强, 刘莉莉, 姚星伟, 孙德岭, 张宝珍, 文正华 申请人:天津科润农业科技股份有限公司