专利名称：一种基于est-ssr标记的花椰菜杂交种种子纯度鉴定的方法
技术领域：
本发明属于农业的蔬菜育种与应用技术领域，具体涉及花椰菜杂交种纯度鉴定方法，是一种基于EST-SSR分子标记技术的杂交种种子纯度鉴定方法。
背景技术：
种子纯度是评价种子质量的关键，也是种子产业的命脉。因种子纯度问题给农户造成大幅减产的事件时有发生，严重影响了农业生产的增产增收和农村社会的稳定。传统的种子纯度鉴定方法是以播种后植株的田间形态观察为依据，其周期长、工作量大，且易受环境、季节因素影响，导致结果存在偏差。因此，开发快速、准确的种子纯度鉴定方法已成为种子科研单位和企业共同关注的课题。近年来随着分子生物学的发展，各种分子标记技术在杂交种纯度的鉴定中得到了大量应用。DNA分子标记是DNA在分子水平上遗传变异的直接反映，它们遗传性稳定，信息量大，不受内外环境的影响，而且具有与基因表达与否无关、检测迅速和操作简便等突出优点，因此，DNA分子标记成为理想的快速鉴定种子纯度的检测方法之一，其中RAPD、RFLP、 AFLP, SSR及ISSR标记等在杂交种纯度鉴定中都有应用。和其它类型DNA分子标记相比，SSR标记具有共显性、多态性高、实验程序简单等优点，是目前遗传多样性和群体遗传结构研究中最常用的标记之一。目前开发的SSR标记主要有基因组SSR和EST-SSR两类。基因组SSR引物的开发通常需要构建基因组文库，花费大，效率低。随着大量表达序列标签(EST)的出现，对于许多植物而言，利用EST数据库开发SSR引物是一项高效、低花费的选择。EST数据库中提供大量的EST数据，可以直接从网上下载使用，再利用相关软件即可设计得到SSR引物。EST序列中SSR的含量较高，大麦(Kota et al. , 2001)、拟南芥 (Cardie et al.，2000)、甘蔗(Cordeiro et al.，2001)、葡萄 Gcott et al.，2000) EST 中分别占3. 6%、3%、2. 8%和2.5%。Kantety等(2002)对大麦、玉米、燕麦和小麦等禾谷类作物EST中SSR含量、出现频率及重复类型的研究结果则表明，禾谷类作物的EST中有 7% W% SSR，3%的序列可用于设计SSR引物；大麦、玉米、小麦、燕麦、黑麦、高粱和水稻等作物的EST中平均6.0 kb出现一个SSR。EST-SSR标记不仅具有基因组SSR标记的多态性高、共显性、重复性好的特点， 而且开发成本相对低廉、在种属间具有良好的通用性。另外，由于部分EST-SSR标记来自于基因的编码区，所以更容易获得基因表达的信息，可为功能基因的直接鉴定提供重要依据。 目前 EST-SSR 标记已被用于小麦(Eujayletal.，2001)、玉米(Wang and Bowen, 1998)、 大麦(Kota et al. , 2001; Thiel et al. , 2003)、甘蔗(Cordeiro et al. , 2001)、葡萄 (Scott et al. , 2001)等的遗传作图(Kota et al.，2001)、遗传多样性(Eujayl et al.， 2001)、基因发掘(Remington etal.，2001; Vigouroux et al.，2002)等研究。迄今为止，尚未有成功利用EST-SSR分子标记技术鉴定花椰菜杂交品种种子纯度的报道。
发明内容
本发明的目的在于公开了一种基于EST-SSR分子标记技术的花椰菜杂交种种子纯度鉴定方法，为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案
用于鉴定花椰菜杂交种种子纯度的1对SSR引物，其特征在于，包括上游引物序列5’_ AGACTTCGTCGATCCACCTG -3，，下游引物序列5，- GACCTCGTCCTCCTCTTCCT -3，。本发明进一步公开了基于EST-SSR标记的花椰菜杂交种种子纯度鉴定的方法，其特征在于包括如下步骤
(1)采用上游引物序列5’ - AGACTTCGTCGATCCACCTG -3，，下游引物序列5，-GACCTCGTCCTCCTCTTCCT -3，的SSR弓丨物对供试品种样品模板DNA进行PCR扩增，其中的PCR 扩增反应的总体积为10 μ L，扩增反应体系为2XGoTaq Master Mixes 5 μ L，上游和下游引物lOymol/L各0. 25 μ L，供试花椰菜杂交种基因组DNA模板，浓度50 ng/yL, 1 μ L，双蒸水补足10 μ L ；PCR反应程序为95°C预变性anin ；32个扩增循环，94°C 40 sec, 56°C 45 sec, 72°C 1 min;72°C延伸 7 min，4°C保存；
(2)对PCR扩增产物进行凝胶电泳，非变性聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%，凝胶组分为去离子水 21 mL，10XTBE 3 mL，40 % PAG 6 mL, TMED 30 μ L，10% 过流酰胺 300 μ L ；设定电压250 V，电泳1 h，关闭电源，进行染色；染色过程银染8 10 min，迅速水洗，NaOH显色数分钟，直至条带清晰即可，再次水洗；
(3)通过分析EST-SSR结果，比较杂交种及其双亲的特征谱带，对供试种子样品进行共显性互补带型分析，通过计算供试品种样品中杂交种数量占总样品数量的比例确定种子纯度。本发明更加详细的花椰菜杂交种进行纯度鉴定的方法如下
本方法通过对供试花椰菜杂交种进行DNA提取、PCR扩增和EST-SSR分析，确认了杂交种及其双亲稳定的共显性互补带型，从而对花椰菜杂交种进行纯度鉴定。供试花椰菜杂交种取样及DNA提取方法为对基地18家农户进行随机取样，每家农户去5株单株，总共90株，取靠近根部的嫩叶部分50 100 mg，液氮冷冻研磨(Retsch MM400 生物粉碎仪)，加入 CTAB 裂解缓冲液(20 g/L CTAB, 1. 4 M NaCl,0. 1 M Tris_HCl，20 mM Na2EDTA) 500 μ L，65°C恒温水浴(Neslab)裂解30min，后续DNA提取纯化按树脂型基因组DNA提纯试剂盒(赛百盛)操作进行。DNA提取后浓度统一稀释至50 士 1 ng/ μ L, Nanodrop ND1000, Thermol)。DNA提取方法也可以按市售试剂盒进行。供试花椰菜杂交种PCR方法为
(1) SSR 上游引物序列5，- AGACTTCGTCGATCCACCTG -3，，SSR 下游引物序列5，-GACCTCGTCCTCCTCTTCCT -3，。(2)采用上述SSR引物对供试品种样品模板DNA进行PCR扩增，其中的PCR扩增反应的总体积为10yL，扩增反应体系为2XGoTaq Master Mixes 5 μ L，上游和下游引物10 μ mol/L各0.25 μ L，供试花椰菜杂交种基因组DNA模板(50 ng/μ L) 1 μ L，双蒸水补足10 μ L ;PCR反应程序为95°C预变性anin，32个扩增循环(94°C 40 sec, 56°C 45 sec, 72°C 1 min) ；72°C延伸 7 min，4°C保存；供试花椰菜杂交种PCR扩增产物进行凝胶电泳，非变性聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%，凝胶组分为去离子水 21 mL，10 X TBE 3 ml AO % PAG 6 mL，TMED 30 μ L，10% 过流酰胺 300 μ L ；设定电压250 V，电泳1 h，关闭电源，进行染色；染色过程银染8 10 min，迅速水洗，NaOH显色数分钟，直至条带清晰即可，再次水洗；
供试花椰菜杂交种EST-SSR结果分析，比较杂交种及其双亲的特征谱带，对供试种子样品进行共显性互补带型分析，通过计算供试品种样品中杂交种数量占总样品数量的比例确定种子纯度。本发明的检测方法在不计算DNA提取过程耗时的情况下，PCR耗时90min，EST-SSR 分析60-90min，所以本发明的检测方法在池之内即可完成种子纯度鉴定工作，具有快速、 低成本、操作方便等优势。1、原理
本方法应用一种新型的核酸分析方法其原理是=EST-SSR是以1 6个碱基为重复单元,是存在于EST中的SSR。EST ( Expressed sequence tag，表达序列标签)是将mRNA 在体外反转录成cDNA并克隆到质粒或噬菌体载体构建cDNA文库后，大规模随机挑取cDNA 克隆，对其5’端或3’端进行测序后获得的长约150 500bp的表达序列片段。EST序列来自实验室构建的cDNA文库或从美国国家生物信息中心(NCBI)的Genbank中下载。采用相关软件合成引物，最后对研究材料进行PCR扩增和凝胶电泳，通过特异谱带进行分析，从而计算杂交种的纯度。 2、引物设计
通过Gene Bank数据库上公布的202条花椰菜EST序列，利用CMD SSR Server在线引物设计，引物由上海生工合成，经筛选获得了 1对EST-SSR引物可用于花椰菜杂交种种子纯度鉴定。引物由上海生物工程公司合成。表1引物序列表如下
权利要求
1.用于鉴定花椰菜杂交种种子纯度的1对SSR引物，其特征在于，包括上游引物序列 5，- AGACTTCGTCGATCCACCTG -3，，下游引物序列5，- GACCTCGTCCTCCTCTTCCT -3，。
2.一种采用权利要求1所述引物，基于EST-SSR标记的花椰菜杂交种种子纯度鉴定的方法，其特征在于包括如下步骤(1)采用权利要求1所述的SSR引物对供试品种样品模板DNA进行PCR扩增，其中的 PCR扩增反应的总体积为10 μ L，扩增反应体系为:2XGoTaq Master Mixes 5 yL，上游和下游引物10 μ mol/L各0. 25 μ L，供试花椰菜杂交种基因组DNA模板，浓度50 ng/ μ L， 1 μ L，双蒸水补足10 4 1^屮0 反应程序为951预变性2 1^11;32个扩增循环，941 40 sec, 56°C 45 sec, 72°C 1 min ;72°C延伸 7 min，4°C保存；(2)对PCR扩增产物进行凝胶电泳，非变性聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%，凝胶组分为去离子水 21 mL，10XTBE 3 mL，40 % PAG 6 mL, TMED 30 μ L，10% 过流酰胺 300 μ L ；设定电压250 V，电泳1 h，关闭电源，进行染色；染色过程银染8 10 min，迅速水洗，NaOH显色数分钟，直至条带清晰即可，再次水洗；(3)通过分析EST-SSR结果，比较杂交种及其双亲的特征谱带，对供试种子样品进行共显性互补带型分析，通过计算供试品种样品中杂交种数量占总样品数量的比例确定种子纯度。
全文摘要
本发明公开了一种用于鉴定花椰菜杂交种种子纯度的方法。该方法以花椰菜杂交种及其双亲的基因组DNA为模板，通过GeneBank数据库上公布的202条花椰菜EST序列，利用CMDSSRServer在线引物设计，设计了36对EST-SSR引物。经过筛选，得到1对杂交种带型为双亲的互补带型引物，经田间验证试验引物稳定性良好，且与田间试验结果较为吻合，能够对花椰菜杂交品种进行纯度鉴定。本发明的检测方法在3h之内即可完成种子纯度鉴定工作，具有快速、低成本、操作方便等优势。
文档编号C12Q1/68GK102443654SQ20121001397
公开日2012年5月9日 申请日期2012年1月17日 优先权日2012年1月17日
发明者兰青阔, 朱珠, 王永, 程奕, 赵新, 郭永泽, 陈锐 申请人:天津市农业科学院中心实验室