对细菌性黑枯病的广谱抗性的制作方法
【专利说明】对细菌性黑枯病的广谱抗性
[0001] 序列提交
[0002] 本申请连同电子形式的序列表一起提交。序列表命名为 2577227SequenceListing.txt，于2012年10月24日创建，大小为29kb。电子形式序列表 的信息完整引入本文作为参考。
[0003] 发明背景
[0004] 本发明涉及提供对植物中黄单胞菌广谱抗病性的合成启动子和合成基因。本发明 还涉及包含所述合成基因的转基因植物，以及通过将植物与这类转基因植物杂交获得的植 物。更具体地，所述合成启动子是合成的XalO启动子，所述合成基因是合成的XalO基因， 其包含合成的XalO启动子。所述抗性是对细菌性黑枯病（bacterialblight)的抗性，所 述植物是稻属植物。
[0005] 本文用于说明本发明背景或提供有关实施的补充细节的出版物和其他材料被引 入作为参考，为了方便起见在文献目录中分别分组。
[0006] 革兰氏阴性的致植物病细菌使用III型分泌系统（TTSS)将效应蛋白转移入植 物细胞，在那里它们调节宿主细胞功能以利于侵入过程（Alfano和Collmer, 2004;Kay 和Bonas，2009)。大的AvrBs3效应家族的成员是独特类型的III型效应物，由黄单胞菌 属（Xanthomonas)和青枯菌属（Ralstoniasolanacearum)的致病变种产生（Bonas等 人，1989 ;Yang和White, 2004 ;Heuer等人，2007)。AvrBs3样效应物，最近也称为转录活 化物样（TAL)效应物（Yang等人，2006 ;B〇gdan〇Ve等人，2010)，通常具有III型分泌所需 的N端以及包含核定位信号（NLS)和酸性活化结构域（AAD)的C端。TAL效应物在中间段 不同，其是通常长度为33-35个氨基酸（aa)、接近完美的重复的区域，结尾于20个氨基酸长 度的截短重复。在重复的第12和13位的两种高变氨基酸，还称为重复可变的双残基（RVD) (Moscou和Bogdanove, 2009)，有助于重复多态性，而TAL效应物中具有多态性RVDs的重复 的数量和次序决定了特异活性（Herbers等人，1992 ;Yang等人，2005)。
[0007] 单个TAL效应物活化特定宿主易感性（S)基因的转录以促进疾病进展（Yang等 人，2006 ;Kay等人，2007 ;Sugio等人，2007 !Antony等人，2010)。为了抵消疾病促进 策略，植物已经进化出利用TAL效应物的转录诱导能力的机制（Gu等人，2005 ;Romer等 人，2007)。因此，TAL效应物的亚组起无致病力效应物的作用，并活化疾病R基因的转录。 TAL效应物结合S或R基因的启动子中的特定DNA序列（Kay等人，2007 ;Romer等人，2007; Romer等人，2009 ;Antony等人，2010)。来自TAL效应物的中央重复的每个RVD特异性识别 在5'端具有保守T的靶DNA元件的核苷酸（Boch和Bonas, 2010 ;Bogdanove等人，2010)。
[0008] 水稻白叶枯病黄单胞菌（Xanthomonasoryzaepv.oryzae)是水稻细菌性黑枯病 的病原体（Nino-Liu等人，2006)。水稻细菌性黑枯病菌的单独株载有11到19个TAL效 应物（White等人，2009)。来自水稻白叶枯病黄单胞菌的TAL效应物靶向水稻基因针对 细菌感染的易感性（Yang等人，2006 ;Sugio等人，2007 ;Chen等人，2010)或抗性（Gu等 人，2005)。来自水稻白叶枯病黄单胞菌？乂09#株的TAL效应物PthXol靶向水稻的0s8N3/ Xal3/0sSWEETll(Yang等人，2006;Chen等人，2010)。Xal3 的隐性等位基因（xal3)对 PthXol无响应，含有xal3的植物对只依赖PthXol作为重要毒性效应物的病原体株具有抗 性（Yang等人，2006)。通过利用TAL效应物AvrXa7和PthXo3的病原体株，利用诱导S基 因0s-llN3(N3基因家族的另一成员），可以去除xal3介导的对水稻细菌性黑枯病的抗性 (Antony等人，2010)。
[0009]PthXo6和PthXo7是来自PX099A的两种其他TAL效应物，分别靶向两种转录因子 基因，水稻的OsTFXl和OsTFIIAyUSugio等人，2007)。OsTFXl编码bZIP转录因子，而 OsTFIIAy1的基因产物是转录因子IIA的小亚基（Sugio等人，2007)。通过PthXo7诱导 位于染色体1的OsTFIIAy1可以反映出PX099A对xa5(OsTFIIAy5的等位基因，编码水稻 的染色体5上的TFIIA小亚基的第二种形式（Sugio等人，2007))介导的抗性的适应（Iyer 和McCouch, 2004)。PthXol的DNA靶序列，EBEpthxcil (PthXol的效应物结合元件），已经在 0s8N3的启动子中被鉴定出（Antony等人，2010)，而PthXo6和PthXo7的DNA靶序列仍待 在OsTFXl和OsTFIIAy1的启动子中鉴定或验证，尽管已经预测出假定的靶序列（Boch等 人，2009)。
[0010] 当水稻植物携带同源R基因Xa7、XalO或Xa27(3种TAL效应物）时，来自PX086的 AvrXa7 和AvrXalO(Hopkins等人，1992)以及来自PX099%3AvrXa27(Gu等人，2005)，激活 抗病性。到目前为止，只有Xa27基因已经被分离和公开（Gu等人，2005)。如果AvrXa27诱 导型启动子被来自水稻PRl基因的应激诱导型启动子替换，则Xa27被AvrXa27诱导，所述 基因可提供对水稻白叶枯病黄单胞菌的非特异性抗性（Gu等人，2005Jian和Yin，2009)。 八￥4&27对乂&27的完整诱导需要〇81?114丫5，其是染色体5上乂 &5的基因产物（611等 人，2009)。在AvrXa27特异性诱导的Xa27的启动子中鉴定出16-到18-bpDNA顺式元 件，称为UPTAwXa27(被TAL效应物AvrXa27 或EBEAwXa27上调）（Boch等人，2009 ;R〇mer 等 人，2009)。
[0011]XalO提供对水稻白叶枯病黄单胞菌的少量菲律宾品种的窄谱品种特异性抗性 (Yoshimura等人，1995)。R基因从水稻栽培品种Cas209基因渗入（introgressed)易感 的水稻品种IR24(Mew，1982 ;Yoshimura等人，1983)。XalO被精细作图位于染色体11长 臂上的近端标记物M491和远端标记物M419之间的0. 28cM遗传区域，并与标记物S723和 M604共分离（Gu等人，2008)。最近通过基于图谱的克隆和遗传转化方法克隆出XalO基因 (国际公开申请号WO2012/033462)。在XalO的启动子中鉴定出AvrXalO的功能性靶序 列，EBEA"Xal。（国际公开申请号WO2012/033462)。XalO基因产物，XA10,通过诱导过敏反应 (HR)样细胞死亡在单子叶植物和双子叶植物中均起作用（未公开的）。
[0012] 由R基因启动子而不是R基因产物决定TAL效应物依赖性R基因对细菌性黑枯 病的抗性特异性（Gu等人，2005)。同时，TAL效应物依赖性R基因针对细菌性黑枯病的抗 性谱变化很大，这依赖于水稻白叶枯病黄单胞菌株中无致病力TAL效应物的可用性（Gu等 人，2004 ;Gu等人，2008)。Romer等人（2009)证明，被不同TAL效应物靶向的多个功能不 同的DNA元件当合并入一个启动子时保留它们的功能和特异性。希望产生针对水稻细菌性 黑枯病的广谱抗性。
[0013] 发明概述
[0014] 本发明涉及提供对植物中黄单胞菌广谱抗病性的合成启动子和合成基因。本发明 还涉及包含所述合成基因的转基因植物，以及通过将植物与这类转基因植物杂交获得的植 物。更具体地，所述合成启动子是合成的XalO启动子，所述合成基因是合成的XalO基因， 其包含合成的XalO启动子。所述抗性是对细菌性黑枯病的抗性，所述植物是稻属植物。
[0015] 因此，在第一个方面，本发明提供一种包括水稻XalO启动子的合成启动子，其已 被修饰以包含多个效应物结合元件（EBE)，每种EBE结合不同的转录活化剂样（TAL)效应 物。在一个实施方案中，所述合成启动子包含EBEpthxci7序列。在另一个实施方案中，所述合 成启动子包含EBEpthxcil序列。在另外的实施方案中，所述合成启动子包含EBEawm。序列。在 其他实施方案中，所述合成启动子包含EBEpthxci6序列。在另一个实施方案中，所述合成启动 子包含EBEAwXa27序列。在另外的实施方案中，所述合成启动子包含所有这5种EBE序列。在 一个实施方案中，所述合成启动子是合成的迷你启动子，其包含所述EBE序列中的1至5种 和具有启动子活性的水稻XalO启动子的最小部分。在另一个实施方案中，所述合成启动子 是合成的全长XalO，其包含EBE序列中的1至5种。在一个实施方案中，所述合成全长启动 子包含合成的迷你启动子。在其他的实施方案中，所述合成启动子是比合成迷你启动子更 大的合成全长启动子的任意片段，其邻接于合成迷你启动子的5'端并且具有启动子活性。
[0016] 在一个实施方案中，合成的迷你启动子包括SEQIDNO:2所示的序列。在另一个实 施方案中，合成的全长启动子包括SEQIDNO: 10所示的序列。在其他实施方案中，合成启 动子包括核苷酸2208-2456和任意数目的核苷酸，其在合成迷你启动子的5'并与所述合成 迷你启动子邻接。在一个实施方案中，EBEpthxci7序列包括SEQIDNO: 5所示的序列。在另一 个实施方案中，EBEpthxcil序列包括SEQIDNO:6所示的序列。在额外的实施方案中，EBEA"Xal。 序列包括SEQIDNO: 7所示的序列。在其他实施方案中，EBEpthxci6序列包括SEQIDNO:8所 示的序列。在另一个实施方案中，EBEA"Xa27序列包括SEQIDN0:9所示的序列。
[0017] 在第二个方面，本发明提供一种合成的XalO基因，其包括与水稻XalO序列可操作 连接的本发明的合成启动子。在一个实施方案中，水稻XalO序列的起始密码子与合成启动 子的3'端邻接。在另一个实施方案中，水稻XalO序列是水稻XalO蛋白的编码序列。在其 他实施方案中，XalO序列是编码水稻XalO蛋白的基因组序列。在另一个实施方案中，水稻 XalO序列是编码序列加包含终止子的3'UTR。在其他实施方案中，水稻XalO终止子（SEQ IDNO: 15的核苷酸382-759)可以被技术人员公知的其他终止子取代，诸如NOS终止子、35S 终止子和Xa27终止子。在一个实施方案中，所述编码序列包括SEQIDNO: 13所示的编码 序列。在另一个实施方案中，编码水稻XalO蛋白的基因组序列包括SEQIDNO: 15所示的 序列，其包括编码序列（核苷酸1-381)和终止子（核苷酸382-759)。在其他实施方案中， 编码水稻XalO蛋白的基因组序列包括SEQIDNO: 16所示的序列，其包括编码序列（核苷 酸1-381)、终止子（核苷酸382-759)和进一步包括3'UTR(核苷酸760-1193)。在另一个 实施方案中，编码水稻XalO蛋白的基因组序列包括SEQIDN0:17所示的序列，其包括编码 序列（核苷酸1-381)、终止子（核苷酸382-759)和进一步包括3'UTR(核苷酸760-2215)。 在另一个实施方案中，水稻XalO序列包括SEQIDNO: 17的核苷酸1-759所示的序列加 SEQIDNO: 17中终止子3'的任意数目的核苷酸（它们邻接于终止子）。在一个实施方案 中，合成XalO基因的序列如SEQIDNO: 11所示。在另一个实施方案中，合成XalO基因的 序列如SEQIDNO: 12所示。
[0018] 在第三个方面，本发明提供一种包括此处所述的合成XalO基因的载体。本发明还 提供一种包括所述载体的植物细胞，以及包括所述植物细胞的具有对细菌性黑枯病广谱抗 性的转基因植物。在一个实施方案中，所述植物细胞是水稻细胞。在另一个实施方案中，所 述转基因植物是转基因水稻植物。
[0019] 在第四个方面，本发明提供一种制备具有对细菌性黑枯病广谱抗性的转基因植物 的方法。根据本发明，所述方法包括用此处描述的合成XalO基因或此处描述的包括合成 XalO基因的载体转染一个或多个植物细胞，并从所述一个或多个转染的植物细胞产生转基 因植物。根据本发明，所述合成XalO基因在转基因植物中表达。将合成XalO基因或载体 转染一个或多个植物细胞有时在本文中也称为利用合成XalO基因或载体转化一个或多个 植物细胞。在一个实施方案中，所述一个或多个植物细胞是一个或多个水稻细胞。
[0020] 在第五个方面，本发明提供一种转基因植物，其具有稳定掺入其基因组的此处描 述的合成XalO基因的至少一个拷贝。在一个实施方案中，所述转基因植物包含合成XalO基 因的两个拷贝。在另一个实施方案中，所述转基因植物包含合成XalO基因的三个拷贝。在 额外的实施方案中，所述转基因植物包含合成XalO基因的四个拷贝。在其他实施方案中， 所述转基因植物包含合成XalO基因的五个拷贝。在另一个实施方案中，所述转基因植物包 含合成XalO基因的六个拷贝。在一个实施方案中，所述植物是水稻植物。在另一个实施方 案中，所述转基因水稻植物在本文中被称为L2植物或L2系。本发明还提供一种植物，其包 含稳定掺入其基因组的此处描述的合成XalO基因，这来源于将此处描述的转基因植物或 其子代与第二种植物杂交并