酿酒酵母中替代甘油形成的消耗电子的乙醇生产途径的制作方法
【专利说明】酿酒酵母中替代甘油形成的消耗电子的乙醇生产途径
[0001] 参考序列表
[0002] 将与本申请一起提交的电子形式提交的序列表（"2608.069PC02_PCT序列表_ ascii.txt"，356, 130字节，创建于2013年11月19日）的内容全部引入本文作为参考。
[0003] 发曰月背景
[0004] 能量转化、利用和获取成为我们时代的许多重大挑战的根本原因，包括与可持续 性、环境质量、安全和生活质量相关的那些。需要新兴技术的新应用以对这些挑战作出响 应。生物技术，一种最有力的新兴技术，可产生重要的新能量转化工艺。植物生物质和其衍 生物是将能量生物转化成对人类有用形式的资源。
[0005] 在植物生物质的形式中，基于颗粒的生物质和木质纤维素生物质（统称为"生物 质"）非常适于能源应用。每种原料具有优势和劣势。例如，因为其大规模可用性、低成本， 和环境友好地生产，木质纤维素生物质作为生物燃料生产的可行的进料（feed)来源受到 关注。特别地，基于纤维素生物质的许多能源生产和利用循环在生命周期的基础上具有接 近零的温室气体排放。
[0006] 然而，基于颗粒的原料更容易通过现有的微生物转化成燃料，但是基于颗粒的原 料比木质纤维素原料更昂贵并且转化成燃料与颗粒的供选择的用途竞争。
[0007] 涉及酶或微生物水解的生物质加工方案通常涉及四种生物介导的转化：（1)产生 糖解酶（纤维素酶和半纤维素酶）；（2)将预处理的生物质中存在的碳水化合物组分水解成 糖；（3)己糖（例如葡萄糖、甘露糖和半乳糖）发酵；和⑷戊糖（例如，木糖和阿拉伯糖） 发酵。这四种转化可发生在被称为联合生物加工（"CBP"）的工艺配置的单个步骤中，所述 工艺配置与其他较不高度整合的配置的区别在于其不涉及用于纤维素酶和/或半纤维素 酶生产的专用处理步骤。
[0008] CBP提供比特征在于专用的纤维素酶生产的过程成本更低和效率更高的潜力。这 些益处部分源自避免了与纤维素酶生产相关的资本成本、底物和其他原料和设备。另外，数 个因素支持使用CBP实现更高的水解速率，并且因此实现减小的反应器体积和资本投资， 所述因素包括酶-微生物协同作用和使用嗜热生物体和/或复杂的纤维素酶体系。而且， 纤维素粘附性分解纤维素的微生物可能与非粘附性微生物成功地竞争纤维素水解的产物， 例如污染物。期望的微生物的成功竞争增加基于微生物纤维素利用的工业过程的稳定性。 开发实现CBP的微生物的进展通过下述两个策略来进行：工程化天然存在的分解纤维素的 微生物，以改善产物相关的特性，如产率和效价；和工程化显示高产物产率和效价的非分解 纤维素的生物体，以表达能够利用纤维素和半纤维素的异源纤维素酶和半纤维素酶体系。
[0009] 符合乙醇生产需求的一种方式是转化生物质中存在的糖以产生乙醇，所述生物质 即比如农业废物、玉米外壳、玉米芯、纤维素材料等的材料。大规模工业应用中有效的生物 质转化需要能够耐受高浓度糖和乙醇的微生物，并且其能够同时发酵多于一种糖。
[0010] 烘焙酵母（酿酒酵母）是用于生产乙醇的优选微生物（Hahn-fMgerdal,B?等， Adv.Biochem.Eng.Biotechnol. 73 :53 - 84(2001))。用于酿酒酵母中乙醇产生的途径可见 图1-3。有利于该微生物的属性是（i)接近理论产率的高产率（0.51g产生的乙醇/g使用 的葡萄糖），（ii)高渗透和乙醇耐受，（iii)工业过程中的天然稳健性，还有（iv)由于其与 葡萄酒和面包制作以及啤酒酿造的长期关联而通常被视为安全的（GRAS)。此外，酿酒酵母 显示对源自生物质预处理的水解产物中常见的抑制剂的耐受。产生乙醇的示例性代谢途径 描绘在图1-4中。
[0011] 然而，甘油是天然酵母乙醇发酵的必要的代谢终产物（图5A)。在碳水化合物上的 厌氧生长期间，乙醇和二氧化碳的产生是氧化还原中性的，而产生细胞生物质和相关的二 氧化碳的反应相对于碳水化合物更多是氧化的。相对于碳水化合物，甘油的产生更多是还 原的，其用作电子冷阱，以抵消细胞生物质形成，以使总体氧化还原中性是守恒的。基于物 质守恒的理论考虑这是必要的，并且在实践中不能产生甘油的菌株不能（或仅仅非常差的 能够）在厌氧条件下生长。
[0012] 有强的商业动机不产生甘油，因为其代表乙醇产率的损失。在工业玉米乙醇发酵 中，对于~140亿加仑/年的市场，该产率损失可高达理论值的6%。以$2. 50/加仑的销售 价格，总市值为$2B/年。
[0013] 解决该问题的来自文献的策略包括通过上调编码谷氨酰胺合酶的GLNl或编码谷 氨酸合酶的GLTl，同时删除编码NADPH-依赖性谷氨酸脱氢酶的GDHl，通过工程化固定氨以 与NADH而不是NADPH作用来减少甘油形成。（Nissen，T.L?等，MetabolicEngineering2: 69-77 (2000))工程化细胞以在糖酵解期间通过表达NADPH产生过量NADPH的另一策略与甘 油酸 _3_ 磷酸脱氢酶相关。（Bro,C?等MetabolicEngineering8:102-111(2006))。
[0014] 然而，大部分甘油还原策略或者仅仅部分减少对甘油形成的需要，或产生乙醇之 外的副产物。本发明通过将通常位于甘油上的电子重定向到乙醇形成中从而减少甘油产生 和增加乙醇产生，来克服这些其他策略的缺陷（图5B，图6)。
[0015] 发明概沐
[0016] 本发明多方面涉及重组微生物，其包括编码磷酸转酮酶的异源核酸；至少一种编 码乙酰辅酶A生产途径中的酶的异源核酸；编码双功能醛-醇脱氢酶的异源核酸；和导致 甘油生产途径中的酶下调的至少一种基因修饰。在一些实施方案中，磷酸转酮酶是具有酶 学委员会编号4. 1. 2. 9的单特异性磷酸转酮酶。在一些实施方案中，磷酸转酮酶是具有酶 委员会编号4. 1. 2. 22的双特异性磷酸转酮酶。本发明多方面涉及重组微生物，其包括至少 一种编码乙酰辅酶A生产途径中的酶的异源核酸；编码双功能醛-醇脱氢酶的异源核酸； 和任选地，至少一种导致甘油生产途径中的酶下调的基因修饰。在一些实施方案中，乙酰辅 酶A生产途径中的酶是具有酶学委员会编号2. 3. 1.8的磷酸转乙酰酶。在一些实施方案中， 乙酰辅酶A生产途径中的酶是具有酶学委员会编号2. 7. 2. 12的乙酸激酶。在一些实施方案 中，双功能醛-醇脱氢酶选自具有以下两个酶学委员会编号的酶：ECI. 2. 1. 10和I.I. 1. 1。 在一些实施方案中，双功能醛-醇脱氢酶是NADPH依赖性双功能醛-醇脱氢酶，其选自具有 以下酶学委员会编号的酶：EC1.2. 1.10和1.1. 1.2。在一些实施方案中，甘油生产途径中 的酶是具有酶学委员会编号I.I. 1. 8的甘油-3-磷酸脱氢酶。在一些实施方案中，甘油生 产途径中的酶是具有酶学委员会编号3. 1. 3. 21的甘油-3-磷酸磷酸酶。
[0017] 在一些实施方案中，微生物进一步包括至少一种另外的上调的酶。在一些实施方 案中，具有酶学委员会编号2. 2. 1. 2的转醛醇酶被上调。在一些实施方案中，具有酶委员 会编号2. 2.I. 1的转酮酶被上调。在一些实施方案中，具有酶学委员会编号5. 3. 1. 6的核 糖-5-P异构酶被上调。在一些实施方案中，具有酶学委员会编号5.I. 3. 1的核酮糖-5-P3-差向异构酶被上调。
[0018] 在一些实施方案中，糖酵解途径中的至少一种酶在微生物中被上调。在一些实施 方案中，糖酵解途径中的酶是具有酶学委员会编号4. I. I. 1的丙酮酸脱羧酶。在一些实施 方案中，糖酵解途径中的酶是醇脱氢酶，其选自具有下述酶学委员会编号的酶：1. I. I. 1和 I.I. 1. 2〇
[0019] 在一些实施方案中，微生物另外包括至少一种基因修饰，其使得醛脱氢酶下调，所 述醛脱氢酶选自具有以下酶学委员会编号的酶：1. 2. 1. 3、1. 2. 1. 4和1. 2. 1. 10。在一些实 施方案中，微生物另外包括至少一种基因修饰，其使得醛脱氢酶上调，所述醛脱氢酶选自具 有以下酶学委员会编号的酶：1. 2.I. 3、1. 2. 1. 4和1. 2. 1. 10。在一些实施方案中，醛脱氢酶 是乙醛脱氢酶。
[0020] 在一些实施方案中，微生物另外包括至少一种基因修饰，其使得甲酸脱氢酶下调， 所述甲酸脱氢酶选自具有以下酶学委员会编号的酶：1. 2. 1. 43和1. 2. 1. 2。
[0021] 在一些实施方案中，微生物另外包括至少一种基因修饰，其使得具有酶学委员会 编号2. 3. 1. 54的丙酮酸甲酸裂解酶上调。在一些实施方案中，微生物另外包括至少一种基 因修饰，其使得具有酶学委员会编号1. 97. 1. 4的丙酮酸甲酸裂解酶活化酶上调。
[0022] 在一些实施方案中，微生物是酵母。在一些实施方案中，微生物来自酵母属 (Saccharomyces)。在一些实施方案中，微生物是酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae)。
[0023] 在一些实施方案中，本文所述的重组微生物以比缺少所述基因修饰的在其他方面 相同的微生物更高的产率产生乙醇。在一些实施方案中，微生物产生比缺少所述基因修饰 的在其他方面相同的微生物高1% -10%的乙醇效价。
[0024] 在一些实施方案中，本文所述的重组微生物以比缺少所述基因修饰的在其他方面 相同的微生物更低的产率产生甘油。在一些实施方案中，微生物产生的甘油效价比缺少所 述基因修饰的在其他方面相同的微生物低10-100%。
[0025] 在一些实施方案中，本发明涉及本文所述的宿主细胞和含碳原料。在一些实施方 案中，原料选自木质生物质、草、糖加工残渣、市政废物、农业废物或其任何组合。在一些实 施方案中，原料包括回收的木浆纤维、锯肩、硬木、软木、稻秸、稻壳、大麦秸杆、玉米芯、谷类 猜杆、小麦猜杆、油菜猜杆、燕麦猜杆、燕麦外壳、玉米纤维、猜杆、肉质植物、龙舌兰、甘鹿 渣、柳枝稷、芒草、造纸污泥、市政废物或其任何组合。
[0026] 在一些实施方案中，本发明涉及使用本文所述的组合物生产发酵产品的方法，其 中组合物的宿主细胞能够发酵含碳原料，生产发酵产品。
[0027] 在一些实施方案中，本发明涉及生产乙醇的方法，其包括提供本文所述的任何宿 主细胞；在存在含碳原料的情况下培养宿主细胞足够的时间以生产乙醇；和任选地，提取 乙醇。
[0028] 在一些实施方案中，本发明涉及减少甘油产生的方法，其包括提供本文所述的 任何宿主细胞，其中所述甘油产生比缺少所述基因修饰的在其他方面相同的微生物少 10-100%。在一些实施方案中，宿主细胞的甘油产生与缺少所述基因修饰的在其他方面相 同的微生物相比减少，并且其中当宿主细胞在存在含碳原料的情况下培养足够的时间以生 产乙醇时，乙醇效价增加至少1-10%。
[0029] 在一些实施方案中，本发明涉及包括至少两种宿主细胞的共培养物，其中一种宿 主细胞包括本文所述的宿主细胞和基因上与本发明的宿主细胞不同的另一种宿主细胞。在 一些实施方案中，共培养物的基因上不同的宿主细胞是酵母或细菌。在一些实施方案中，基 因上不同的宿主细胞是来自以下属的任何生物体：酵母属、伊萨酵母属（Issatchenkia)、 毕赤酵母属（Pichia)、棒孢酵母属（Clavispora)、假丝酵母属（Candida)、汉逊酵 母属（Hansenula)、克鲁维酵母属（Kluyveromyces)、木霉属（Trichoderma)、嗜热子 囊菌属（Thermoascus)、埃希氏菌属（Escherichia)、梭菌属（Clostridium)、热解纤 维素菌属（Caldicellulosiruptor)、发酵单胞菌属（Zymomonas)、嗜热厌氧杆菌属 (Thermoanaerobacter)和嗜热厌氧菌属（Thermoanaerobacterium) 〇
[0030] 附图/图简休
[0031]图1描绘了利用单特异性磷酸转酮酶从葡萄糖到乙醇的简化代谢途径。催化可适 于本发明步骤的酶的名字以斜体显示。
[0032] 图2描绘了利用双特异性磷酸转酮酶从葡萄糖到乙醇的简化代谢途径。催化可适 于本发明步骤的酶的名字以斜体显示。
[0033]图3描绘了不使用磷酸转酮酶从葡萄糖到乙醇的简化代谢途径。催化可适于本发 明步骤的酶的名字以斜体显示。
[0034] 图4描绘了乙酰-磷酸（"乙酰-P"）到乙醇的供选择的转化。
[0035] 图5描绘了（A)野生型酿酒酵母在厌氧生长期间利用的简化的碳和氧化还原途 径。乙醇形成是氧化还原中性的，而细胞生物质形成产生净NADH，其通过甘油形成平衡；和 (B)用PHK-PTA-ADHE途径工程化的酿酒酵母用乙醇的产生平衡在细胞生物质形成期间产 生的NADH。
[0036] 图6描绘了通过其在总代谢途径的背景下可消除或下调甘油形成的机制。
[0037]图7描绘了使用单特异性和双特异性磷酸转酮酶的等价代谢相互转化。
[0038] 图8描绘了PCR构建和在给定的靶基因座将KT-MX和NT-MX整合盒整合进入每个 染色体的两个拷贝的示意图。（A)转化的PCR装配体包含四种PCR产物，与靶位点的上游 序列同源的5'侧翼（pi)，KT-MX盒（p2)，NT-MX盒（p3)，和与靶位点的下游序列同源的3' 侧翼（p4)。使用产生每个PCR产物的同源重叠延伸的引物，独立扩增每个组分。弯曲虚线 表示KT/NT-MX盒和5'侧翼之间的同源性，以及弯曲实线表示与3'侧翼的同源性。⑶用 KT-MX和NT-MX替换靶位点之后的染色体的示意图。
[0039] 图9描绘了用于用"Mascoma装配体"在两条染色体上在靶基因座处替换整合的 KT-MX和NT-MX选择盒的策略的示意图。Mascoma装配体（"MA"）用于确定当它们在生物 体内重组时形成期望的构造的一系列重叠PCR产物。在该文件中，给出M数以表示待通过 重组来装配的分子组分的组合。（A)转化的Mascoma装配体包含一定量的PCR产物，其取决 于期望的工程化事件（PX)、与靶位点的上游序列同源的5'侧翼（pi)和与靶位点的下游序 列同源的3'侧翼（p4)。使用产生同源重叠延伸的引物独立扩增每种组分。重叠弯曲线表 示在那些PCR产物末端的同源性。（B)在FUDR上选择和用Mascoma装配体替换遗传标志物 之后的染色体的示意图。
[0040] 图10描绘了青春双歧杆菌（B.adolescentis)PTA的整合方案和（A)青春双歧 杆菌？册、出）植物乳杆菌（1^?1&拉&^1111)?册1，和（〇在酿酒酵母？0￥1位点的黑曲霉 (A.niger)PHK0
[0041] 图11描绘了与不包含整合的PTA和PHK的菌株M3293相比，包含整合的PTA和 PHK的酿酒酵母菌株M4008、M4409和M4410的改善的厌氧生长速率。
[0042] 图12描绘了与不包含整合的PTA和PHK的菌株M329