增加植物的光合作用及产量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种增加植物的光合作用及产量/生长的方法、以及该方法中使用的 转化植物。
【背景技术】
[0002] 在产生全球气候变化及粮食短缺的危机的现代，发现使陆地植物的0)2摄入提高 的方法是越来越重要的课题。作为〇) 2摄入的主要器官的气孔，为被位于表皮的2个特殊 细胞（也被称为保卫细胞）包围的微细的孔，主要在陆地植物中在其叶面上被发现。由于 叶面几乎不透过空气及水，因此，气孔可提供用于周边大气和叶的内部之间的C02、O2及水 蒸气的扩散的主要路径。气孔打开引起的气体交换的促进为植物的光合作用及蒸腾作用中 的最不可缺少的过程中的一个（1、2)。近年来的研究显示：气孔蒸腾为水稻中的光合作用 的限制因子（3)、并且蒸腾的减少导致农作物（例如小麦）的养分吸收降低（4)。因此，气 孔打开/气孔蒸腾的增加促进光合作用，且由此预料增加植物生长。但是，就本发明的发明 人所知，关于植物生长的增加，未曾报导操作气孔开度的研究的成功例。所认为的理由之一 在于，由于气孔也起到水闸的作用（5)，因此，难以平衡经由该气孔而失去水蒸气的同时摄 入CO2的利弊。
[0003] 光为刺激气孔开口的主要因子之一，另外，各种各样的机制是响应于各种光波长 进行的气孔开口的基础（6~8)。认为红光引起经由叶肉及保卫细胞叶绿体中的光合作用 的气孔打开、以及细胞间隙CO2浓度（Ci)的降低（5、9、10)。但是，关于相对于红光的气孔 应答的详细的机制，则正在议论之中（11、12)。相比之下，蓝光作为信号起作用，相对于气孔 打开发挥最显著的效果。蓝光受体向光素（photl及phot2)经由羧基末端第2位苏氨酸的 磷酸化和随后的磷酸化苏氨酸与14-3-3蛋白质的结合而将细胞膜H+-ATPase活化（13~ 15)。利用蓝光被活化的细胞膜H+-ATPase引起细胞膜的超级化，由此可以经由内向整流性 K+通道（细胞膜K+in通道）进行K+的摄入（16~20)。K+的蓄积引起保卫细胞的膨胀及气 孔打开。因此，上述3个因子（向光素、细胞膜H+-ATPase及细胞膜K+in通道）在蓝光引起 的气孔打开中起到重要的作用。除这些因子之外，暗示FLOWERINGLO⑶ST(FT)为气孔打 开的正的调节因子（21)。
【发明内容】
[0004] 被植物表皮内的一对保卫细胞所包围的气孔的孔，响应于光、〇)2及作为植物激素 的脱落酸（ABA)进行应答而调节植物和大气之间的气体交换。光引起的气孔打开通过至少 3个主原因子一一蓝光受体向光素、细胞膜H+-ATPase及细胞膜K+in通道一一而介导。虽然 气孔阻力认为是植物摄入〇)2的主要限制因子，但几乎没有进行以光合作用及植物生长的 增加为目标使气孔打开增大的尝试。
[0005] 在此，本发明的发明人示出：使用保卫细胞启动子、即保卫细胞特异性地高表达的 基因的启动子（GC1启动子）过表达细胞膜H+-ATPase(AHA2)的拟南芥属的转化植物显示光 引起的气孔打开、光合作用及植物成长（植物的产量）的增大。该转化植物在生长开始第25 天产生比野生型大且增加的数目的莲座叶，其湿重及干重约大42~63%。播种后第45天 的转化植物的、包含种子和长角果及花的全花茎的干重与野生型的全花茎的干重相比约大 36~41%。此外，该转化植物的气孔响应于黑暗条件及脱落酸而正常地关闭。相比之下， 保卫细胞中的向光素或细胞膜!(二通道的过表达对这些表现型没有影响。这些结果证明： 气孔开度为光合作用及植物生长中的限制因子，另外，在保卫细胞中使细胞膜H+-ATPase过 表达引起的气孔打开的操作对植物生长的促进是非常有用的。
[0006]SP，本发明包含以下发明。
[0007] [1] 一种转基因植物，其过表达AHA2基因。
[0008] [2]根据[1]所述的转基因植物，所述转基因植物利用保卫细胞特异性地高表达 的基因的启动子、优选GCl启动子过表达AHA2基因。
[0009] [3]根据[1]所述的转基因植物，所述转基因植物为双子叶植物。
[0010] [4]根据[3]所述的转基因植物，所述转基因植物属于十字花科。
[0011] [5]根据[4]所述的转基因植物，所述转基因植物属于拟南芥属或芸苔属。
[0012] [6]根据[4]所述的转基因植物，所述转基因植物选自由拟南芥（Arabidopsis thaliana)、甘蓝型油菜(Brassicanapus)、油菜花(Brassicarapavar. nippo-oleifera)、甘蓝（Brassicaoleraceavar.capitata)、西兰花(brassicaoleracea var.italica)、花挪菜（Brassicaoleraceavar.botrytis)及大白菜（Brassicarapa var.pekinensis)构成的组。
[0013] [7]根据[1]所述的转基因植物，所述转基因植物为单子叶植物。
[0014] [8]根据[7]所述的转基因植物，所述转基因植物属于禾本科。
[0015] [9]根据[8]所述的转基因植物，所述转基因植物属于稻属、玉蜀黍属、甘蔗属或 尚梁属。
[0016] [10]根据[8]所述的转基因植物，所述转基因植物选自由高粱（Sorghum bicolor)、稻（Oryzasativa)、非洲稻（Oryzaglaberrima)、甘鹿（Saccharum officinarum)、玉米（Zeamays)、大麦（Hordeumvulgare)及小麦（Triticumaestivum)构 成的组。
[0017] [11] -种增加植物的产量的方法，包括在该植物中导入用于过表达AHA2基因的 基因修饰。
[0018] [12] -种增加植物中的光合作用的方法，包括在该植物中导入用于使AHA2基因 过表达的基因修饰。
[0019] [13]根据[11]或[12]所述的方法，其中，AHA2基因处于保卫细胞特异性地高表 达的基因的启动子、优选GCl启动子的控制下。
[0020] [14]根据[11]或[12]所述的方法，其中，所述植物为双子叶植物。
[0021] [15]根据[14]所述的方法，其中，所述植物属于十字花科。
[0022] [16]根据[15]所述的方法，其中，所述植物属于拟南芥属或芸苔属。
[0023] [17]根据[15]所述的方法，其中，所述植物选自由拟南芥（Arabidopsis thaliana)、甘蓝型油菜(Brassicanapus)、油菜花(Brassicarapavar. nippo-oleifera)、甘蓝（Brassicaoleraceavar.capitata)、西兰花(brassicaoleracea var.italica)、花挪菜（Brassicaoleraceavar.botrytis)及大白菜（Brassicarapa var.pekinensis)构成的组。
[0024] [18]根据[11]或[12]所述的方法，其中，所述植物为单子叶植物。
[0025] [19]根据[18]所述的方法，其中，所述植物属于禾本科。
[0026] [20]根据[19]所述的方法，其中，所述植物属于稻属、玉蜀黍属、甘蔗属或高粱 属。
[0027][21]根据[19]所述的方法，其中，所述植物选自由高粱（Sorghumbicolor)、稻 (Oryzasativa)、非洲稻（Oryzaglaberrima)、甘鹿（Saccharumofficinarum)、玉米（Zea mays)、大麦（Hordeumvulgare)及小麦（Triticumaestivum)构成的组。
[0028] 本说明书通过参照而引入作为本申请优先权基础的美国临时申请第61/777, 655 号的说明书、专利权利要求书及附图中所记载的内容。
[0029] 附图简述
[0030] 图1显示利用了GCl启动子的AHA2的过表达（GC1::AHA2)促进气孔打开。GCl:: AHA#1及GCl::AHA#2是指分别独立地得到的转化植物。（A)为拟南芥属植物的表皮中的 保卫细胞H+-ATPase的免疫组织化学检测的典型的荧光图像（关于免疫组织化学条件的 详细，请参照材料及方法的项）。（B)为野生型（WT)及GCl: :AHA2中的AHA2及TUB2的 RT-PCR分析。将TUB2(TUBULINBETACHAIN2)作为对照基因使用。（C)为2. 5小时的黑暗 下、2. 5小时的光照射（50ymolm2S1的红光及10ymolm2S1的蓝光）下或2. 5小时的光 照射下且20yMABA的存在下的气孔开度。（D)为照射蓝光30分钟的表皮中的典型的气 孔。光条件与（C)相同。（E)为黑暗下或30分钟的光处理后的气孔开度。光条件设为与 (C)相同。（C)及（E)的气孔开度为与25个气孔有关的测定值的平均值；误差棒表示标准 误差（SEM)。气孔开度的差异使用学生t-检验进行检测CwP< 0. 001)。（F)为从播种后 第4周的WT及AHA2-转化植物切断的莲座叶的湿重的变化的动态。叶的相对重量作为相 对于初期重量（从植物体切断之后的各莲座叶的重量）的比例表示。数据为10片叶的平 均值；误差棒表不标准偏差（SD)。
[0031] 图2显示AHA2-转化植物的气体交换特性。野生型（WT)及AHA2转化植物中的 (A)气孔导度的光应答以及（B)0)2同化速度。用380yLL1的CO2进行测定；叶温及叶室 的相对湿度分别维持在24°C及40~50%。（C)为野生型及AHA2-转化植物中的CO2同化 速度和细胞间隙CO2浓度的关系。在约750ymolm2S1的白光下进行测定。叶温及叶室内 的相对湿度分别维持在24°C及40~50%。数据为与3个不同的植物体有关的测定值的平 均值；误差棒表示SD，另外，比记号小的情况没有表示。白的四角为野生型植物；深蓝色的 圆及浅蓝色的三角为AHA2-转化植物。
[0032] 图3显示AHA2-转化植物的表现型的特征。（A)及⑶为在强光条件（200ymol m2S 4下生长了 25天的野生型及AHA2-转化植物的表现型。（C)为在强光条件下生长的野 生型AHA2-转化植物的莲座叶及幼叶。（D)为播种后第25天的植物体的相对的地上部的 湿重及干重。（E)为在强光条件下生长了 50天的野生型及AHA2-转化植物的表现型。（F) 为播种后第45天的植物的相对干茎重。湿重及干重为6个体以上的植物体的测定值的平 均值；误差棒表示SEM。对差异通过学生t-检验进行检测CnP< 0. 05、，< 0. 005、 < 0? 001)〇
[0033] 图4显示使用了GC