一种可增强植物光合作用的蛋白及其编码基因和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种可增强植物光合作用的蛋白及其编码基因和应用，本发明所公开的蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示，其编码基因核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2所示，本发明还公开了该蛋白及其编码基因在增强植物光合作用中的应用。将本发明的基因转化目的植物后，转基因植物出现气孔增多、光合效率提高的生理特征，能够更加高效的利用二氧化碳并且耐受高浓度的二氧化碳浓度，若广泛应用，既可以增加作物的产量，又可以有效减少大气中的二氧化碳浓度，缓解温室效应带来的影响。
【专利说明】一种可增强植物光合作用的蛋白及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学【技术领域】，涉及一种可增强植物光合作用的蛋白及其编码基因和应用。
【背景技术】
[0002]由于我国的可利用性耕地资源的逐步减少，使得粮食安全成为了国家性的一个重大战略性问题，在当前报账粮食安全作为我国长期国策的背景下，如何实现粮食作物产量水平的持续提升是横贯在我国社会经济、农业科技前进道路上的一道难题。
[0003]光合作用是决定作物产量的最重要因素之一，作物中90%以上的干重直接来源于光合作用。植物气孔(Plantstomata)是植物与外界进行气体交换的重要通道，是影响植物光合作用的一个重要因素，气孔的开度和气孔的密度决定了植物光合作用的能力和效率。目前，在双子叶模式植物拟南芥(Arabidopsisthaliana)的气孔图式发育的研究中，气孔蛋白(Stomagen) /气孔蛋白前体(ST0MAGEN)是唯一一个正向调控气孔生成的分泌肽类信号蛋白，通过增加植株体内气孔蛋白的数量可增加叶片的气孔密度，并且能够使植株的光合速率提高30%。
[0004]几十年来，世界作物学家一直致力于通过改良植物气孔数目来提高粮食作物光合作用碳同化效力、培育出高光效、高水分利用率、高产量粮食作物的育种研究，当前，通过基因工程育种获得具有高气孔密度的植物品质是一种行之有效的方法，该方法中最关键的技术瓶颈问题是与气孔密度有关的相关基因的筛选与功能发现，但目前对禾本科植物气孔发育途径知之甚少，至今仍未获得突破性进展。玉米(Zea mays)是单子叶模式植物，又是世界三大粮食作物之一，研究玉米气孔蛋白基因的功能和作用机制，能够完善单子叶植物气孔图式发育的研究，为培育高光效单子叶粮食作物的遗传育种工作提供科学理论依据。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于针对上述技术问题，提供一种可增强植物光合作用的蛋白及其编码基因，以及该蛋白及其编码基因在培育高气孔密度的转基因植物中的应用。
[0006]为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是:
[0007]一种可增强植物光合作用的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0008]一种编码SEQ ID NO:1所示蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0009]含有核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示的基因的植物表达载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌；所述植物表达载体优选为双元农杆菌表达载体，所述宿主菌优选为农杆菌。
[0010]优选地，所述双元农杆菌表达载体为表达载体PGSA1252。
[0011]氨基酸序列如SEQ ID NO:1的蛋白、核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示的基因以及含有该基因的表达载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌在增强植物光合作用中的应用。
[0012]一种培养高光合作用的转基因植物的方法，是将核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的基因导入目的植物过表达，得到高光合作用的转基因植物；所述方法是通过农杆菌介导法将基因转化目的植物组织，并将转化的组织培养成植株，所述目的植物优选为玉米；该方法包括下列步骤:
[0013]将核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的基因克隆进植物表达载体，得到重组表达载体；再将重组表达载体转入农杆菌，制备含重组表达载体的农杆菌菌液，使用农杆菌菌液侵染目的植物组织，通过农杆菌介导法将基因转化目的植物组织，再将转化的组织培养成植株。
[0014]本发明的基因可以用于调节植物气孔发育、增强植物光合作用，还可作为遗传标记，用于农业生产中的产品鉴定。将该基因转化目的植物后，转基因植物出现气孔增多、光合效率提高的生理特征，能够更加高效的利用二氧化碳并且耐受高浓度的二氧化碳浓度，若广泛应用，既可以增加作物的产量，又可以有效减少大气中的二氧化碳浓度，缓解温室效应带来的影响。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为转基因玉米的分子鉴定；
[0016]图2为转基因玉米与非转基因玉米叶片下表面气孔分布；
[0017]图3为转基因玉米与非转基因玉米ZmSTOMAGEN基因的表达量；
[0018]图4为转基因玉米与非转基因玉米光响应曲线。
【具体实施方式】
[0019]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0020]下述实施例中使用的种子`、仪器、试剂、试剂盒、载体均可从市场上购买得到；
[0021]实施例
[0022]1.ZmSTOMAGEN 基因的克隆
[0023]1.1获得玉米幼叶
[0024]玉米骨干亲本昌7-2种子经过24小时吸胀萌发之后，置于50001x 土表光强，恒温25°C, 16小时光照/8小时黑暗的条件下进行培养。当培养至幼苗刚长出第二片叶时，取该叶片液氮冻存。
[0025]1.2 提取总 RNA
[0026]采用本领域常用的酚/氯仿抽提法提取玉米RNA。
[0027]1.3目的基因的RT-PCR扩增
[0028]1.3.1逆转录反应
[0029]使用Takara 的 ReverseTranscriptaseM-MLV(TakaraCode = D2639A)试剂盒，参照说明书进行进行逆转录反应，合成cDNA第一链。
[0030]1.3.2拟南芥ST0MAGEN基因在玉米中的同源比对分析
[0031]从NCBI (www.ncb1.nlm.nih.rov)数据库中搜索到拟南芥气孔蛋白前体
[0032]ST0MAGEN的编码序列(AK175876.1)和氨基酸序列(BAD43639.1)，然后通过该网站的BLASTn、BLASTp和BLASTx工具进行玉米B73的核酸和氨基酸序列的同源比对。分析比对的结果发现，得分最高的核苷酸序列为ΝΜ_001149748.1(Maxident:77%, Totalscore: 105),得分最高的氨基酸序列 % ΝΡ_001143220.1 (BLASTpMaxident:48%, Totalscore:98.2;BLASTxMaxident:55%, Totalscore:94.0)。 序列ΝΜ_001149748.1和序列ΝΡ_001143220.1实为同一基因的mRNA序列和氨基酸序列，这个基因的GeneID为100275730，具有一个全长为372bp的编码区序列(Codingdomainsequence, CDS) (site68_439bp),编码一个具有 123 个氛基酸的小分子多肽，多肽链上第24~123个氨基酸与NCBIProteinClusters数据库中的PLN03207蛋白家族(www.ncb1.nlm.nih.gov/proteinclusters/?term=PLN03207)具有序歹丨J 相似性(BlastSCOre:392)。目前，对该基因功能的研究未见报道，NCBI数据库中对该基因的注释仍为假定蛋白基因。
[0033]1.3.3玉米ST0MAGEN同源基因的克隆
[0034]设计玉米B73中NM_001149748.1序列117~489bp片段的扩增引物，以玉米昌7-2幼叶的cDNA为模板，进行PCR扩展，上游引物序列如SEQIDN0:3所示，下游引物序列如 SEQIDN0:4 所示，PCR 反应程序为:95°C 5min ；95°C 30s, 56°C 30s, 72°C 28s, 25 个循环；72°C IOmin0获得的扩增片段大小为417bp，将该扩增片段进行测序，所获得的序列与NM_001149748.1序列进行比对，，发现这个在玉米昌7_2中新克隆的基因与之前同源比对发现的基因(NM_001149748.1)属于同一个基因。因此，将该新克隆的玉米基因暂命名为ZmSTOMAGEN,将其编码的蛋白命名为ZmSTOMAGEN。
[0035]2.ZmSTOMAGEN基因表达载体的构建和重组质粒的转化
[0036]根据ZmSTOMAGEN的⑶S以及酶切信息，利用多克隆位点和/或⑶S不完全片段将目的基因克隆到双元农杆菌表达载体PGSA1252上，构建玉米ZmSTOMAGEN过量表达载体PGSA1252-0E,并将过量 表达载体pGSA1252_0E的阳性质粒通过化学转化法和三亲接合法分别转入大肠杆菌DH5 α和农杆菌LBA4404、ΕΗΑ105中。
[0037]3.获得ZmSTOMAGEN基因过表达的转基因玉米植株
[0038]3.1种子收集
[0039]收取授粉后10~15d的H1-1i玉米，在4°C冰箱中存放两天。
[0040]3.2种子灭菌
[0041]在超菌工作台内将小段的玉米棒放在瓶中，先用75%的酒精侵泡30s，倒掉酒精，用无菌水冲洗3次，倒掉无菌水；再用0.1%的升汞侵泡8min，倒掉升汞,用无菌水冲洗8次。
[0042]3.3剥离幼胚
[0043]先准备好几个灭菌的1.5mL的EP管，管中加入ImL的无菌水，用手术刀小心地将种子底部的幼胚挑出，将幼胚放入之前准备好的EP管中存放。
[0044]3.4准备侵染液
[0045]准备携带气孔基因ZmSTOMAGEN过表达载体的农杆菌(pGSA1252_0E)菌液，菌液的0D600=1.0，在50mL的YEA培养基中加入500uL菌液，28°C，180rpm/h,摇菌6h左右，待菌液的0D600=1.0时,将菌液倒入50mL的离心管中，4°C, 12000rpm/m,离心IOmin,弃上清,沉淀用PH1-A培养基重悬至0D600=1.0。所述PH1-A培养基的配方如表1所示:
[0046]表1培养基配方[0047]
【权利要求】
1.一种可增强植物光合作用的蛋白，其特征在于:所述蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。
2.一种编码权利要求1所述蛋白的基因，其特征在于:所述基因的核苷酸序列如SEQID NO:2 所示。
3.含有权利要求2所述的基因的植物表达载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌。
4.按照权利要求3所述的植物表达载体，其特征在于，所述植物表达载体为双元农杆菌表达载体。
5.按照权利要求3所述的宿主菌，其特征在于，所述宿主菌为农杆菌。
6.权利要求1所述的蛋白或权利要求2所述的基因在增强植物光合作用中的应用。
7.权利要求3所述的的植物表达载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌在增强植物光合作用中的应用。
8.一种培养高光合作用的转基因植物的方法，其特征在于:将权利要求2所述的基因导入目的植物过表达，得到高光合作用的转基因植物。
9.按照权利要求8所述的方法，其特征在于:所述方法是通过农杆菌介导法将权利要求2所述的基因导入目的植物组织实现基因的过表达，并将转化的组织培养成植株；所述目的植物为玉米。
10.按照权利要求9所述的方法，其特征在于:所述方法包括下列步骤: 将权利要求2所述的基因克隆进植物表达载体，得到重组表达载体；再将重组表达载体转入农杆菌，制备含重组表达载体的农杆菌菌液，使用农杆菌菌液侵染目的植物组织，通过农杆菌介导法将基因转化目的植`物组织，再将转化的组织培养成植株。
【文档编号】C07K14/415GK103833837SQ201410074835
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年4月7日 优先权日:2014年4月7日
【发明者】樊宪伟, 廖权能, 韦葳, 李有志 申请人:广西大学