一种抗冻保护剂的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种抗冻保护剂的制备方法，而提供一种材料易得，生产成本低的抗冻保护剂的制备方法。在谷朊粉水溶液中加入碱性蛋白酶进行酶解，酶解液经分离、透析除盐、冷冻干燥得到抗冻保护剂；所得抗冻保护剂中含有的多肽分子量分布在8.04-50.12KDa。本发明的抗冻保护剂的制备方法采用碱性蛋白酶酶解谷朊粉中含有的大量的蛋白，通过对碱性蛋白酶切割条件的确定，制备出具有抗冻活性的物质，可作为在低温环境下减少细胞损伤的保护剂，制备方法简单，原料来源广泛，原料成本低，有利于降低抗冻保护剂的成本。而且，抗冻活性更加突出，热滞活性能够达到0.2℃左右。
【专利说明】一种抗冻保护剂的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，特别是涉及一种抗冻保护剂的制备方法。
【背景技术】
[0002]在低温冷链的众多食品加工和运输过程中、在医学器官移植等各个领域中，由于环境温度的波动变化而反复地遭受冰晶生长和重结晶的问题越来越受到人们的关注。温度的反复升降使冰晶不断生长、冻融和重结晶，严重破坏细胞和组织结构而失去产品应有的品质。如何控制冰晶生长及重结晶，实现低温冷链上的冰晶生长控制，是制约众多食品和医药广品品质的关键所在。
[0003]抗冻蛋白(ant1-freezing proteins, AFP)是一类具有特殊功能的蛋白质,其存在于各种生命体中。它通过与冰晶结合来降低冰晶生长的温度和改变冰晶形成的大小和形态，从而起到重结晶抑制效应；而且它能以非依数性形式降低水溶液的冰点而对其熔点影响甚微，于是导致水溶液的熔点(melting point, MP)和冰点(freezing point, FP)之间出现一定的热滞活性(thermal hysteresis activity, THA)而产生热滞效应,从而帮助各种生物体抵御寒冷的环境。
[0004]最近的研究结果表明:抗冻蛋白的抗冻活性片断只存在于局部的特异性多肽链结构域，并不是整体蛋白质在起作用，即使经过纯化的抗冻蛋白的热滞活性也不高。因此，获得安全的、结构紧凑的高活性抗冻多肽就成为新兴的的研究方向。
[0005]目前，植物性抗冻蛋白的提取主要集中在高山高寒地区的高山雪莲、黑麦草、内蒙古沙冬青等植物性原材料，但这些原材料不易得到，成本高，并且其提取方法以“冰手指法”为主，不适合大规模的生产。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，而提供一种材料易得，生产成本低的抗冻保护剂的制备方法。
[0007]为实现本发明的目的所采用的技术方案是:
[0008]一种抗冻保护剂的制备方法，在谷朊粉水溶液中加入碱性蛋白酶进行酶解，酶解液经分离、透析除盐、冷冻干燥得到抗冻保护剂；酶解条件为:碱性蛋白酶的浓度为2-6%，底物浓度为8%-12%、溶液pH值为7-9，酶解温度为45°C _65°C，酶解时间为0.5h_2h。
[0009]所述分离为在4-10°C条件下6000-10000r/min离心。
[0010]所述透析除盐采用3.5KDa的透析袋，在4_10°C的条件下透析24h。
[0011]所述冷冻干燥为在-72~_80°C的条件下干燥24_36h。
[0012]所得抗冻保护剂中含有的多肽分子量分布在8.04-50.12KDa。
[0013]与现有技术相比，本发明的有益效果是:
[0014]1、本发明的抗冻保护剂的制备方法采用碱性蛋白酶酶解谷朊粉中含有的大量的蛋白，通过对碱性蛋白酶切割条件的确定，制备出具有抗冻活性的多肽混合物，可作为在低温环境下减少细胞损伤的保护剂，制备方法简单，原料来源广泛，原料成本低，有利于降低抗冻保护剂的成本。而且，抗冻活性更加突出，热滞活性能够达到0.2°C左右。
[0015]2、本发明的制备方法在制备过程中，不添加任何有毒有害物质，同时，谷朊粉本身就是一种可食用性的植物性原材料，所得抗冻保护剂为天然产品，因此可以以添加剂的形式大规模的应用于食品行业。
[0016]3、本发明的制备方法通过酶解分离、透析除盐、冷冻干燥等方法从谷朊粉中得到多肽的混合物，即抗冻保护剂，操作过程简单，易于实现大规模生产。而且，显著的提高了谷朊粉的利用价值，为小麦谷朊粉的深加工提供了新的途径。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1为本发明实施例1中抗冻保护剂Tricine SDS-PAGE的电泳图谱；
[0018]图2为本发明实施例1中抗冻保护剂的熔点扫描图谱；
[0019]图3为本发明实施例1中抗冻保护剂当保留温度为-0.70°C时的冰点扫描图谱；
[0020]图4为本发明实施例1中抗冻保护剂冰晶生长及抑制冰晶生长效果图，其中A表示50mg/ml牛血清蛋白的冰晶生长图，B表示抗冻保护剂的冰晶生长图；
[0021]图5为本发明实施例2中抗冻保护剂的熔点扫描图谱；
[0022]图6为本发明实施例2中抗冻保护剂当保留温度为-0.50°C时的冰点扫描图谱；
[0023]图7为本发明实施例2中抗冻保护剂冰晶生长及抑制冰晶生长效果图，其中A表示50mg/ml牛血清蛋白的冰晶生长图，B表示抗冻保护剂的冰晶生长图；
[0024]图8为本发明实施 例3中抗冻保护剂的熔点扫描图谱；
[0025]图9为本发明实施例3中抗冻保护剂当保留温度为-0.20°C时的冰点扫描图谱；
[0026]图10为本发明实施例3中抗冻保护剂冰晶生长及抑制冰晶生长效果图，其中A表示50mg/ml牛血清蛋白的冰晶生长图，B表示抗冻保护剂的冰晶生长图。
【具体实施方式】
[0027]以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。
[0028]实施例1
[0029](I)抗冻保护剂的制备
[0030]称取IOg谷朊粉，按照底物浓度8%的比例加入水溶解，调节溶液的pH值为8.0。按照碱性蛋白酶的浓度为5%加入碱性蛋白酶，酶解温度为45°C，酶解时间为lh。酶解后所得溶液在8°C、10000r/min的条件下离心15min,取上清液,在4°C下,3.5KDa的透析袋内透析除盐24h，在-72°C的条件下冷冻干燥24h，得到抗冻保护剂。
[0031](2) Tricine SDS-PAGE测抗冻保护中多肽的分子量分布范围
[0032]将所得抗冻保护剂用超纯水配制成lmg/ml的溶液,经Tricine SDS-PAGE电泳测定，Tricine SDS-PAGE电泳图谱如图1所示，图中有条带出现，说明所得抗冻保护剂中含有多肽成分，其分子量分布在8.04KDa-50.12KDa的范围之间。
[0033](3)所得抗冻保护剂进行热滞活性的测定
[0034]将抗冻保护剂用超纯水配制成10mg/ml的溶液，取10 μ I置于铝制液体坩埚中，按照下述的温控程序进行热滞活性的测定:[0035]a、以5°C /min的速率由室温降至_30°C，保持5min ；
[0036]b、以1°C /min的速率由_30°C升至20°C，记录样品熔点Tm ；
[0037]C、以 1°C /min 的速率由 20°C 降至 _30°C，保持 5min ；
[0038]d、以1°C /min的速率由_30°C升至固液混合态的任一温度点(保留温度Th)，保留2min ；
[0039]e、以1°C /min的速率由Th降至_30°C,记录样品体系开始结晶的温度Ttl ；
[0040]计算热滞活性THA=Th-Ttl。
[0041]熔点扫描图谱如图2所示，测得抗冻保护剂熔点Tm=_2.43°C，当确定其保留温度Th=-0.70°C时，冰点扫描图谱如图3所示，冰点Ttl=-0.92°C，经计算得:抗冻保护剂热滞活性THA=Th-T0=0.22。。。
[0042](4)抗冻保护剂冰晶生长及抑制冰晶生长效果图的观察:
[0043]将抗冻保护剂及牛血清蛋白用超纯水分别配制成50mg/ml的溶液，取1.5 μ I置于载玻片上，按照下述的温控程序进行冰晶的观察:
[0044]a、以30°C /min的速率由室温降至_30°C，保持5min ；
[0045]b、以 30°C /min 的速率由 _30°C升至 20°C ；
[0046]C、以 20°C /min 的速率由 20°C 降至 4°C，保持 Imin ；
[0047]d、以 24°C /min 的速率由 4°C 降至 _20°C ；
[0048]e、以 1.5°C /min 的速率由 _20°C升至 _6°C ；
[0049]f、以 1°C /min 的速率由 _6°C升至 _5°C ；
[0050]g、以 1°C /min 的速率由-5°C 降至 _35°C,保持 15min。
[0051]在-35°C下，以普通的牛血清蛋白作为对照，对比观察本发明抗冻保护剂的晶体生长状况。
[0052]在放大1000倍的条件下观察，所得对照结果如图4所示。从图4可以看出:按设定的温控程序反复融冻之后，与牛血清蛋白的冰晶体相比，在此条件下制备的抗冻保护剂冰晶体更加大小一致、致密均匀，表现出极强的抑制重结晶的能力。
[0053]实施例2
[0054]( I)抗冻保护剂的制备
[0055]称取15g谷朊粉，按照底物浓度10%的比例加入超纯水溶解，调节溶液的pH为8.5，按照酶浓度为4%加入碱性蛋白酶，酶解温度为50°C，酶解时间为1.5h。酶解所得溶液在4°C、8000r/min的条件下离心20min,取上清液,在6°C下,3.5KDa的透析袋内透析除盐24h，在-72°C的条件下冷冻干燥36h，得到抗冻保护剂。
[0056](2) Tricine SDS-PAGE测抗冻保护剂中多肽的分子量分布范围
[0057]将所得抗冻保护剂用超纯水配制成lmg/ml的溶液,经Tricine SDS-PAGE电泳测定，Tricine SDS-PAGE电泳图谱中有条带出现，说明所得抗冻保护剂中含有多肽成分，其分子量分布在8.04KDa-50.12KDa的范围之间。
[0058](3)所得抗冻保护剂进行热滞活性的测定
[0059]将抗冻保护剂用超纯水配制成10mg/ml的溶液，取10 μ I置于铝制液体坩埚中，按照实施例1的温控程序进行热滞活性的测定，熔点扫描图谱如图5所示，测得抗冻保护剂熔点Tm=-2.27°C,当确定其保留温度Th=-0.500C时，冰点扫描图谱如图6所示，冰点T0=-0.71 °C，经计算得:抗冻保护剂热滞活性THA=Th-Ttl=0.21 °C。
[0060](4)抗冻保护剂冰晶生长及抑制冰晶生长效果图的观察
[0061]将抗冻保护剂及牛血清蛋白用超纯水分别配制成50mg/ml的溶液，取1.5 μ I置于载玻片上，按照实施例1的温控程序进行冰晶的观察，在放大1000倍的条件下观察，所得对照结果如图7所示。从图7可以看出:按设定的温控程序反复融冻之后，与牛血清蛋白的冰晶体相比，在此条件下制备的抗冻保护剂冰晶体大小一致、致密均匀，表现出极强的抑制重结晶的能力。
[0062]实施例3
[0063]( I)抗冻保护剂的制备
[0064]称取5g谷朊粉，按照底物浓度9%的比例加入超纯水溶解，调节溶液的pH为9.0，酶浓度为3%，酶解温度为45°C，酶解时间为1.5h，所得溶液在6°C、7000r/min的条件下离心30min，取上清液，在4°C下，3.5KDa的透析袋内透析除盐36h，在-72 °C的条件下冷冻干燥24h，得谷朊粉抗冻保护剂。
[0065](2) Tricine SDS-PAGE测抗冻保护剂中多肽的分子量分布范围
[0066]将所得抗冻保护剂用超纯水配制成lmg/ml的溶液,经Tricine SDS-PAGE电泳测定，Tricine SDS-PAGE电泳图谱中有条带出现，说明所得抗冻保护剂中含有多肽成分，其分子量分布在8.04KDa-50.12KDa的范围之间。
[0067](3)所得抗冻保护剂进行热滞活性的测定
[0068]将抗冻保护剂用超纯水配制成10mg/ml的溶液，取10 μ I置于铝制液体坩埚中，按照实施例1的温控程序进行 热滞活性的测定，熔点扫描图谱如图8所示，测得抗冻保护剂熔点Tm=-2.38°C,当确定其保留温度Th=-0.200C时，冰点扫描图谱如图9所示，冰点T0=-0.41 °C，经计算得:抗冻保护剂热滞活性THA=Th-Ttl=0.21 °C。
[0069](4)抗冻保护剂冰晶生长及抑制冰晶生长效果图的观察
[0070]将抗冻保护剂及牛血清蛋白用超纯水分别配制成50mg/ml的溶液，取1.5 μ I置于载玻片上，按照实施例1的温控程序进行冰晶的观察，在放大1000倍的条件下观察，所得对照结果如图10所示。从图10可以看出:按设定的温控程序反复融冻之后，与牛血清蛋白的冰晶体相比，在此条件下制备的抗冻保护剂冰晶体大小一致、致密均匀，表现出极强的抑制重结晶的能力。
[0071]本发明以小麦淀粉生产的副产物谷朊粉为原料，通过碱性蛋白酶酶解制备抗冻保护剂，所得抗冻保护剂中含有多肽成分，分子量分布在8.04KDa-50.12KDa之间，热滞活性高达0.2°C左右。所得抗冻多肽混合物产品可应用于农业、医学、食品等行业，从而实现谷朊粉的有效增值和利用。
[0072]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种抗冻保护剂的制备方法，其特征在于，在谷朊粉水溶液中加入碱性蛋白酶进行酶解，酶解液经分离、透析除盐、冷冻干燥得到抗冻保护剂；酶解条件为:碱性蛋白酶的浓度为2-6%，底物浓度为8%-12%、溶液pH值为7-9，酶解温度为45 °C -65°C，酶解时间为0.5h_2h。
2.根据权利要求1所述的抗冻保护剂的制备方法，其特征在于，所述分离为在4-10°C条件下 6000-10000r/min 离心。
3.根据权利要求1所述的抗冻保护剂的制备方法，其特征在于，所述透析除盐采用3.5KDa的透析袋，在4-10°C的条件下透析24h。
4.根据权利要求1所述的抗冻保护剂的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥为在-72~-80°C的条件下干燥24-36h。
5.根据权利要求1所述的抗冻保护剂的制备方法，其特征在于，所得抗冻保护剂中含有的多肽分子量分布在8 .04-50.12KDa。
【文档编号】C07K1/34GK103805667SQ201410074320
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年3月3日 优先权日:2014年3月3日
【发明者】刘爱国, 赵源 申请人:天津商业大学