专利名称：蔓枯病菌侵染西瓜或甜瓜生长速度的检测方法
技术领域：
本发明涉及植物病害抗性鉴定的技术领域，尤其是涉及一种西瓜和甜瓜蔓枯病菌 分生孢子萌发和菌丝生长速度的快速检测方法。
背景技术：
西瓜和甜瓜植物在全世界范围内广泛栽培，以其营养价值高、产值好，备受消费 者和广大农民的欢迎。西瓜和甜瓜品种很多，而西瓜和甜瓜植物的蔓枯病(stem blight) 是一种危害非常严重的病害，育种学家、植物病理学家和农民等都非常关注。蔓枯病无论 在保护地或露地栽培均有发生，其病原无性世代为半知菌亚门，瓜壳二孢真菌(Didymella bry0niae(AuerSW. )Rehn)，有性世代为子囊菌亚门甜瓜球腔菌。病菌以分生孢子器和子囊 壳在病残体或土壤越冬，翌年以分生孢子进行初次侵染，通过气流、水、土壤传播，也可由带 菌种子传播。该病在西瓜和甜瓜的幼苗期至采收期均可发生，植株的地上各部均能被侵染， 生育前期易发病，生殖生长盛期达高峰。无论是在冬春日光温室，还是早春和秋后大棚栽培 均有发生，其危害程度远高于西瓜和甜瓜枯萎病和疫病，在生产上若不及早防治，植株死亡 率可达30% 40%，造成严重减产。目前该病的防治措施主要是种子消毒、无菌苗移栽、水 肥科学管理和药剂保护等，其中，农业防治效果有限，化学防治又容易产生抗药性、农药残 留和环境污染，因此，推广使用西瓜和甜瓜抗性品种是最为经济有效的办法。在研究西瓜和 甜瓜抗性的病理学研究中，检测蔓枯病菌在西瓜和甜瓜的叶片上分生孢子的萌发速度和菌 丝的生长是非常重要的实验。以往病理学家在研究真菌在植物叶片上侵染时，分生孢子的 萌发速度和菌丝的生长速度，都是采用病菌接种整株植物小苗，然后取整张叶片在Trypan blue染色液中煮沸lmin，水合三氯乙醛内脱色，显微镜上观察孢子萌发率、菌丝生长速度 等。但是这个实验方法，存在一定的缺陷。整张植物叶片对拟南芥这种小的植物是可以的， 但是对西瓜和甜瓜以及其他蔬菜等叶片比较大的植物，染色和脱色操作难度很大，显微镜 观察取样随机性太大，大大妨碍了大叶片的蔬菜上真菌抗性检测时检测真菌生长速度的准 确性。本发明把前人的方法加以改进，提出一种适合大叶片的植物检测病原真菌生长速度 的植物病理学和生理学方法。
发明内容
本发明目的是，针对已有真菌侵染植物叶片时病菌的生长速度的染色方法的操作 不方便、取样难度大等的不足，提出一种简便、快速、准确的蔓枯病菌侵染西瓜和甜瓜的生 长速度的检测方法。本发明的目的是通过以下技术方案予以实现。蔓枯病菌侵染西瓜和甜瓜叶片生长速度的检测方法，该方法按如下步骤进行 (1)取西瓜或甜瓜的幼苗的第3-5片真叶，并剪成IcmX 5cm的叶条，平展摆放到培 养皿滤纸之上；(2)把西甜瓜蔓枯病菌的孢子悬浮液10 μ L轻轻滴至叶条的一端；(3)用灭 菌的大头针穿过孢子液滴或者灭菌水滴，刺穿叶片；(4)把步骤(3)的培养皿放置人工气候箱内，调温度至25-30°C，培养1-5天，每天添加一次保鲜液l-3mL; (5)让步骤(4)后的叶 条在trypan blue染色液内煮沸lmin，然后在水合三氯乙醛内脱色至少30min，纯水冲洗叶 条上的水合三氯乙醛溶液；(6)观察刺穿孔周围细胞死亡情况、孢子萌发和菌丝生长情况。在一些优选的方式中，蔓枯病菌孢子悬浮液的准备将西瓜或者甜瓜蔓枯病菌 (浙江省农业科学院植物与微生物研究所经济作物病害研究室分离保存)接种在PDA培养 基(马铃薯200克煮沸10分钟，过滤汤汁，弃固体薯块，取滤液，然后加蔗糖20克，琼脂17 克，纯水定容至1升，灭菌备用)上25°C培养7天，并在40W紫外灯(12h紫外灯/12h黑暗) 下处理4d诱导产孢。用灭菌水洗下孢子，配成5 X IO5个/mL孢子悬浮液，备用。在另外的优选方式中，培养皿准备包括取9cm直径培养皿，底部铺设用11.8mg/L 的苯骈咪唑(Benzimidazole)溶液植物保鲜液浸湿的滤纸。在另外一些优选的方式中，trypan blue染色液包括乳酸10mL，甘油10mL，苯酚 10g，台酚蓝 IOmg, 7jC IOmL0保温和保湿把培养皿放置人工气候箱内，调温度至25-30°C。每天添加一次保鲜 液l-3mL为可选项目。叶条培养的时间可以是6-72小时之间，较优选的，培养时间为12-48 小时。
本发明的有益效果一是本发明应用简便、快速，仅需剪刀、滤纸、一组培养皿和一个人工气候箱，即可 在室内进行操作。二是本发明技术原理明确，即利用西甜瓜蔓枯病菌主要由植株伤口侵入，且在较 大湿度环境下发病迅速的特点，剪取叶条，限制发病空间，取样简单，使接种发病试验既快 速，又准确可靠。三是试验表明，应用本发明方法能在室内条件下，4天内即可快速鉴定出蔓枯病菌 在侵染不同的西瓜和甜瓜品种时的生长速度，省时省力，与传统的蔓枯病菌生长速度的检 测方法相比，节省时间，操作简单，极大地提高了工作效率。
图1本发明方法快速检测流程示意图。实验一蔓枯病菌在西瓜上的生长速度测定为了进一步说明本发明，现给予实验说明。结合图1的流程示意图，采用如下方法 进行。(1)植株苗子准备西瓜浙蜜2号种子消毒、播种，出苗后长至3-5片真叶，备用。(2)蔓枯病菌孢子悬浮液的准备将蔓枯病菌(浙江省农业科学院植物与微生物 研究所经济作物病害研究室分离保存)接种在PDA培养基(马铃薯200克煮沸10分钟，过 滤汤汁，弃固体薯块，取滤液，然后加蔗糖20克，琼脂17克，纯水定容至1升，灭菌备用)上 25°C培养7天，并在40W紫外灯(12h紫外灯/12h黑暗)下处理4d诱导产孢。用灭菌水洗 下孢子，配成5 X IO5个/mL孢子悬浮液，备用。(3)培养皿准备取9cm直径培养皿，底部铺设用11. 8mg/L的苯骈咪唑 (Benzimidazole)溶液(植物保鲜液)浸湿的滤纸，备用。(4)叶片准备取步骤⑴苗子第3-5片真叶剪成lcmX5cm的叶条，平展摆放到步骤(3)培养皿滤纸之上，备用。(5)孢子接种吸取步骤(2)孢子悬浮液10 μ L轻轻分别滴至步骤(4)培养皿内西瓜叶条的一端。接种灭菌水的叶条为对照。灭菌的大头针穿过孢子液滴或者灭菌水滴， 刺穿叶条。(6)保温和保湿把步骤(5)的培养皿放置人工气候箱内，调温度至25-30°C，每天添加一次保鲜液l_3mL(ll. 8mg/L的苯骈咪唑(Benzimidazole)溶液)。(7)叶条培养48小时后，每个处理分别取3个叶条，放置到trypan blue染色液(乳酸10mL，甘油10mL，苯酚10g，台酚蓝10mg，水IOmL)内煮沸lmin，然后在水合三氯乙醛 内脱色至少30min，脱色结束后，纯水冲洗叶条，去除水合三氯乙醛溶液。(8)脱色后的叶条小心轻放平展至载玻片上，Nikon显微镜下IOX 10观察刺穿孔周围细胞死亡情况，三个叶条处理，每死亡穿孔测3个直径，共9个数据取平均值。40 X 10 观察孢子萌发和菌丝生长情况，每叶条观察10个视野，共30个视野的分生孢子萌发率及菌 丝伸长度，取平均值。实验结果接种后48小时取样，显微镜下测微尺测量，穿孔周围植物细胞死亡平均直径是 1719 μ m,孢子平均萌发率是92%，菌丝平均伸长290 μ m。实验二蔓枯病菌在甜瓜上的生长速度测定为了进一步说明本发明，现给予实验说明。结合图1的流程示意图，采用如下方法进行。(1)植株苗子准备甜瓜白沙蜜种子消毒、播种，出苗后长至3-5片真叶，备用。(2)蔓枯病菌孢子悬浮液的准备将蔓枯病菌(浙江省农业科学院植物与微生物 研究所经济作物病害研究室分离保存)接种在PDA培养基(马铃薯200克煮沸10分钟，过 滤汤汁，弃固体薯块，取滤液，然后加蔗糖20克，琼脂17克，纯水定容至1升，灭菌备用)上 25°C培养7天，并在40W紫外灯(12h紫外灯/12h黑暗)下处理4d诱导产孢。用灭菌水洗 下孢子，配成5 X IO5个/mL孢子悬浮液，备用。(3)培养皿准备取9cm直径培养皿，底部铺设用11. 8mg/L的苯骈咪唑 (Benzimidazole)溶液(植物保鲜液)浸湿的滤纸，备用。(4)叶片准备取步骤(1)苗子第3-5片真叶剪成IcmX5cm的叶条，平展摆放到步骤(3)培养皿滤纸之上，备用。(5)孢子接种吸取步骤(2)孢子悬浮液10 μ L轻轻分别滴至步骤⑷培养皿内甜瓜叶条的一端。接种灭菌水的叶条为对照。灭菌的大头针穿过孢子液滴或者灭菌水滴， 刺穿叶条。(6)保温和保湿把步骤(5)的培养皿放置人工气候箱内，调温度至25-30°C，每天添加一次保鲜液l_3mL(ll. 8mg/L的苯骈咪唑(Benzimidazole)溶液)。(7)叶条培养24小时后，每个处理分别取3个叶条，放置到trypan blue染色液(乳酸10mL，甘油10mL，苯酚10g，台酚蓝10mg，水IOmL)内煮沸lmin，然后在水合三氯乙醛 内脱色至少30min，脱色结束后，纯水冲洗叶条，去除水合三氯乙醛溶液。(8)脱色后的叶条小心轻放平展至载玻片上，Nikon显微镜下10X 10观察刺穿孔周围细胞死亡情况，三个叶条处理，每死亡穿孔测3个直径，共9个数据取平均值。40 X 10观察孢子萌发和菌丝生长情况，每叶条观察10个视野，共30个视野的分生孢子萌发率及菌 丝伸长度，取平均值。实验结果接种后24小时取样，显微镜下测微尺测量，穿孔周围植物细胞死亡平均直径是856 μ m,孢子平均萌发率是35 %，菌丝平均伸长99 μ m。本文中用来描述方法的术语和表达方式并不是唯一不变的，并且我们没有任何意 图使用这些术语和表达方式来排除描述本方法或者特征的任何相同意义的表达方式，我们 认同在本发明声明的范围内的各种不同的表达方式。因此，我们认为尽管在本文中本发明 已经用各种具体方案和任意的特征描述清楚地展示出来，但是改变本文中揭示的设计的 表达方式还要求助于那些有经验的专业技术人士，并且这些改变要与本发明附带的声明一 致。文章、专利、专利应用和所有其它文档的内容以及本文中提到的和引证的有用的 电子化信息是结合在一起的，必须作为一个完整的内容来参考，发表其中任何一个部分都 要特别指明这一点。申请者具有将任何和全部的这些文章、专利、专利应用或其它文档的信 息和材料合并入该申请书作为本专利说明书揭示的一部分的权利。
权利要求
一种蔓枯病菌侵染西瓜或甜瓜生长速度的检测方法，包括如下步骤(1)取西瓜或甜瓜的幼苗的第3-5片真叶，并剪成1cm×5cm的叶条，平展摆放到培养皿滤纸之上；(2)把西瓜或甜瓜蔓枯病菌的孢子悬浮液10μL轻轻分别滴至西瓜或甜瓜叶条的一端；(3)用灭菌的大头针穿过孢子液滴，刺穿叶片；(4)把步骤(3)后的培养皿放置人工气候箱内，调温度至25-30℃，培养1-5天，每天添加一次保鲜液1-3mL；(5)让步骤(4)后的叶条在trypanblue染色液内煮沸1min，然后在水合三氯乙醛内脱色至少30min，纯水冲洗叶条上的水合三氯乙醛溶液；(6)观察刺穿孔周围细胞死亡情况、孢子萌发和菌丝生长情况。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述的蔓枯病菌孢子悬浮液的准备包括将西瓜或 甜瓜蔓枯病菌(浙江省农业科学院植物与微生物研究所经济作物病害研究室分离保存)接 种在PDA培养基(马铃薯200克煮沸10分钟，过滤汤汁，弃固体薯块，取滤液，然后加蔗糖 20克，琼脂17克，纯水定容至1升，灭菌备用)上25°C培养7天，然后在40W紫外灯(12h 紫外灯/12h黑暗)下处理4d诱导产孢；最后用灭菌水洗下孢子，配成5 X IO5个/mL孢子 悬浮液。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述培养皿准备包括取9cm直径培养皿，底部铺 设用11.8mg/L的苯骈咪唑(Benzimidazole)溶液作为植物保鲜液来浸湿滤纸。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述的trypan blue染色液包括乳酸10mL，甘油 10mL，苯酚 10g，台酚蓝 IOmgjjC IOmL0
5.如权利要求1所述的方法，其中，所述的培养时间为12-48小时。
全文摘要
本发明公开了一种蔓枯病菌侵染不同西瓜和甜瓜品种时生长速度的检测方法，该方法包括田间采样、病菌培养、剪叶条、接种病菌、分生孢子萌发和菌丝生长等几个步骤。该方法只需在人工气候箱内使用培养皿内滤纸保湿即可接种病菌，显微镜下直接观察染色、脱色后的叶条即可，具有设备要求简单、应用简便快速、取样简单可靠的特点，适于在病原菌的致病性测定、植物的抗性鉴定等。
文档编号C12Q1/02GK101798589SQ200910266638
公开日2010年8月11日 申请日期2009年12月31日 优先权日2009年8月13日
发明者任海英, 方丽, 王汉荣, 茹水江 申请人:浙江省农业科学院