一种烟草角斑病菌的分子鉴定引物及鉴定方法
【专利摘要】本发明公开了一种烟草角斑病菌的分子鉴定引物及鉴定方法。该烟草角斑病菌的分子鉴定引物如序列表SEQIDNO:1至SEQIDNO:2所示，其中，序列SEQIDNO:1为鉴定烟草角斑病菌的上游引物，序列SEQIDNO:2为鉴定烟草角斑病菌的下游引物。本发明所述烟草角斑病菌分子鉴定引物可以特异性鉴定烟草角斑病病菌。此外，本发明还提供了可靠、特异性强、灵敏度高的烟草角斑病菌快速分子鉴定的方法。
【专利说明】一种烟草角斑病菌的分子鉴定引物及鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种烟草角斑病菌的分子鉴定引物及鉴定方法，属于植物病菌检测领 域。
【背景技术】
[0002] 烟草是我国重要的经济作物之一。烟草角斑病（Pseudomonas syringae pv.angulata)是烟草主要的细菌性病害，在我国北方烟区发生严重，每年均造成一定程度 的危害和经济损失。
[0003] 传统细菌的分类鉴定主要是基于形态学特征、致病性测定、生理生化特性等，工作 繁琐，时间长，鉴定时还易受人为及环境等诸多因素的干扰，而且不能直接从植物组织中检 测出病原菌，难以满足病害控制中快速、灵敏、稳定的检测要求，很容易错过病害防治的最 佳时期，而免疫血清学鉴定方法特异性较差，常常受到抗血清质量的影响，容易造成假阳 性，因此这些方法的应用均受到一定的限制。目前，我国官方机构进行细菌鉴定过程中主要 采用传统的分类学鉴定以及生物学鉴定（16S rRNA序列测定分析）相结合的方式，鉴定时 间至少需要1个月以上，对于农业生产过程中所面临的需要及时快速鉴定的病原菌，这些 方法存在明显的不足。随着生物技术在病害鉴定方面开发应用及病菌DNA数据在基因库中 的不断积累，使分子生物学方法鉴定细菌种类技术日趋完善和成熟。建立细菌的PCR特异 鉴定引物，利用细菌分离培养技术及PCR技术，可以在（1-2) d内对初期侵染的细菌进行鉴 定，从而指导烟农及时准确用药，对保障我国烟叶生产具有重要的意义。
[0004] 对于烟草角斑病的分子鉴定方法，河南农业大学的蒋世君等2010年申请了中国 专利CN 101206193"快速检测和鉴定烟草野火病菌和角斑病菌的方法"，该方法涉及的角斑 病菌的PCR鉴定引物设计于hrpZ基因，且同时扩增出烟草野火病菌，也就是说不能有效区 分野火病和角斑病或者其它丁香假单孢菌。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对现有技术中烟草角斑病菌的生物学检测方法特异性差、灵敏 度低、周期长、血清学鉴定方法成本高并易造成假阳性等问题，提供烟草角斑病菌特异分子 鉴定引物以及可靠、特异性强、灵敏度高的烟草角斑病菌快速分子鉴定的方法。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0007] 基于烟草角斑病的AvrPphE基因区域设计合成了烟草角斑病菌特异的PCR鉴定引 物，该引物可以特异鉴别烟草角斑病菌，烟草野火病菌、其它的丁香假单孢菌及烟草叶面分 离的其它细菌分离物均扩增不出特异的条带。
[0008] 具体地，一组烟草角斑病菌的分子鉴定引物，如下：
【权利要求】
1. 一组烟草角斑病菌的分子鉴定引物，其特征在于，该引物如序列表SEQ ID NO :1至 SEQ ID NO :2所示，其中，序列SEQ ID NO: 1为鉴定烟草角斑病菌的上游引物，序列SEQ ID NO :2为鉴定烟草角斑病菌的下游引物。
2. -种烟草角斑病菌的鉴定方法，其特征在于，该方法包括以下步骤： (1) 烟草角斑病菌分离培养； (2) PCR扩增；其中，PCR扩增时的引物为序列SEQ ID NO :1所示的用于鉴定烟草角斑 病菌的上游引物，序列SEQ ID NO :2所示的用于鉴定烟草角斑病菌的下游引物； (3) PCR扩增产物分离及结果判别。
3. 根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，烟草角斑病菌分离培养的具体步骤 为：用灭菌的剪刀将烟草角斑病疑似病叶病斑剪下，消毒后置于LB固体培养基中25°C培养 2-3天，收集病斑周围长出的细菌菌落于无菌的LB液体培养基中，混匀后，吸取菌液涂LB固 体平板，25°C培养2-3天，挑取单菌落于LB液体培养基中，25°C培养，用于PCR检测，或者直 接用灭菌牙签蘸取单菌落用于PCR检测。
4. 根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，PCR扩增产物分离及结果判别的具体 步骤为：将PCR扩增产物用1. 5%琼脂糖电泳分离，于紫外分析仪中根据扩增产物的大小判 定结果。
【文档编号】C12Q1/04GK104212896SQ201410445480
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年9月3日 优先权日:2014年9月3日
【发明者】万秀清, 乔婵, 李若, 李丽杰, 王春军, 元野, 贺国强, 颜培强, 李尊强, 郭思达, 孙宏伟, 焦玉生, 李恒全, 邱恩建, 刘德育, 陈荣平, 黄磊, 张海霞, 刘伟, 魏继承 申请人:中国烟草总公司黑龙江省公司牡丹江烟草科学研究所