专利名称：防治西瓜细菌性果斑病生防菌株1jn2及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于农业生物技术领域，涉及防治西瓜细菌性果斑病生防菌株1JN2及其应用。
背景技术：
西瓜细菌性果斑病(Bacterialfruit blotch of watermelon, BFB)是西瓜上的一种危险性检疫病害，又称细菌性斑点病，该病最早于1969年由Crall和Schenck在美国佛罗里达州发现，当时只是对果斑病症状进行了描述，未做病原菌的鉴定；目前为止，在我国许多省市，像新疆，陕西，河北，山西，吉林，福建，甘肃等地都已有果斑病的报道。该病害主要危害果实，引起西瓜果实腐烂等，可造成毁灭性损失，一旦发病用药防治基本没有效果。而且带菌种子将成为下一年重要的初侵染源。该病的发生严重影响了西瓜的产量和品质，成为西瓜生产上亟待解决的难题之一。该病害是由燕麦嗜酸菌西瓜亚种(Acidovorax avenae subsp. citrulli, Aac)引起的，西瓜果斑目前在瓜类作物中无免疫品种。西瓜细菌性果斑病是一种毁灭性的细菌性病害，大田生长期不易被发现，且发病突然、发展迅速，由于目前还没有发现种子处理的更好方法，目前生产中所采用的化学药剂有农用链霉素，可杀得，新植霉素，细菌杀，叶双青， 加瑞农，琥胶肥酸铜等，虽然化学药剂对该病有一定的防治效果，但是防治效果不高，而且大量使用化学杀菌剂往往会造成环境污染、农药残留，以及引起病原菌抗药性等问题。生物防治是一种安全有效的防治手段，符合农业持续发展的方向。
发明内容
本发明的目的针对西瓜产业潜在危害较大的西瓜细菌性果斑病，提供开发一种防治西瓜细菌性果斑病的单一生防菌菌株及其应用。本发明的目的可通过如下技术方案实现一种防治西瓜细菌性果斑病病害的生防菌株1JN2，分类命名为Bacillus axarquiensis, 2012年I月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO. 5731。用所述的保藏号为CGMCC NO. 5731的生防菌株1JN2制备的生防菌剂。所述的保藏号为CGMCC NO. 5731的生防菌株1JN2在防治西瓜细菌性果斑病中的应用。所述保藏号为CGMCC NO. 5731的生防菌株IJN2用于制备生防菌剂的方法将所述的保藏号为CGMCC NO. 5731的防治西瓜细菌性果斑病的生防菌株1JN2在LB培养液中 280C 180rpm振荡培养12_16h，然后6000rpm离心lOmin，用灭菌水进行稀释制成菌剂，菌剂成品中活菌总浓度为I X IO9-I X 101QCFU/mL。所述的保藏号为CGMCC NO. 5731的生防菌株1JN2制备的生防菌剂在防治西瓜细菌性果斑病中的应用。该菌剂可以兑水喷雾使用，或做成堆肥使用，也可稀释后在移栽时灌根。有益效果本发明的优点和积极效果表现在本发明是专门针对西瓜细菌性果斑病病害开发的生防制剂。由于是生物制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，因而有利于西瓜的无公害生产，农民可以不用或减少其他化学农药的用量，这不仅可为农民节省开支，而且有利于西瓜的出口贸易。温室大棚试验结果显示，含1JN2(CGMCC NO. 5731)的生防菌剂对西瓜的促生作用效果显著，生物量增加达到55. 92% (表I)，并且该生防菌剂对西瓜果斑病病害防效显著， 高达 50. 13% (表 2)。生物样品保藏信息生防菌株1JN2,分类命名为Bacillus axarquiensis,于2012年I月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO. 5731。
具体实施例方式实施例I—种防治西瓜细菌性果斑病病害的生防菌株1JN2,为Bacillus axarquiensis,由山东省莱芜市生姜茎内分离得到。其具体分离、筛选、鉴定方法如下I生防菌株IJN2的分离剪掉生姜茎部3g，用1%的次氯酸钠ImL浸5min，70%酒精浸2min，无菌水清洗3 次。(取最后一次清洗的溶液0. ImL涂R2A,或取0. ImL最后一次清洗液加入R2A培养液， 30°C振荡培养，若48h后无菌生长则认为表面消毒干净)。用灭菌的研砵研碎表面消毒好的茎，加3mL无菌水，无菌棉布过滤，用无菌水稀释10倍，取0. ImL涂LB平板，每个点重复 3次，28°C培养48h，计数，挑取平板上所有的菌落分离纯化，-70°C、40%甘油保存备用。2生防菌株1JN2的筛选 将西瓜细菌性果斑病病原菌燕麦嗜酸菌西瓜亚种(Acidovoraxavenae) FC440(JianjunFeng, Erin L. Schuenzel, Jianqiang Li, and Norman ff. Schaad. 2009. Multilocus Sequence Typing Reveals Two Evolutionary Lineages of Acidovorax avenae subsp. Citrulli. Bacteriology. 99 (8) :913-920)在 LB 培养液(氯化钠 lOg/L,膜蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，调节pH值为7. 2)中培养16-24h至CFU为108/ml)，加入熔化冷却至40°C左右的固体培养基中，体积比I : 200，将培养基每20mL倒入9cm直径的平板中。待冷却凝固后，牙签接种生防菌1JN2。置于28°C恒温培养箱培养，24h后记录抑菌圈环径，挑取抑菌圈最大的命名为1JN2，于2012年I月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所，菌种保藏号为 CGMCC NO. 5731。3生防菌株1JN2的鉴定3. I生防菌株1JN2的形态特征菌落扁平、灰白色，边缘波纹状，较粘稠，菌体直杆状，大小为2. 0 X 0. 5 ii m，单生、
4对生或成短链状、丝状，周生多根鞭毛，内生孢子为椭圆形，在末端未膨大的孢子囊中，好气性，革兰氏反应阳性。3. 2生防菌株1JN2的生理生化特征将生防菌1JN2活化在LB平板上(氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L， 调节pH值为7. 2)，28°C培养24h，用牙签挑取单菌落分别接种到蛋白酶，几丁质酶，纤维素酶，以及嗜铁素酶活测定的平板上，置于28°C恒温培养箱培养，培养2-3d，测量透明圈直径的大小。表I. Bacillus axarquiensis 1JN2 的生理生化特征
菌株编号蛋白酶透明圈直径 (cm)几丁质酶透明圈直径(cm)纤维素酶透明圈直径(cm)嗜铁素透明圈直径 (cm)1JN2203I3. 3生防菌株1JN2的分子学鉴定细菌基因组试剂盒(赛百盛公司)提取细菌基因DNA后，用gyrB通用引物 gyrBl (SEQ ID NO. I) ；gyrB2R(SEQ ID NO. 2)从基因组 DNA 中扩增出 gyrB 基因片段。具体扩增体系及程序(25ul)如下引物 gyrB U gyrB2R (IOuM)各 I yl ；Mix 12. 5u I ；Taq 0. 5u I0 ddH20 :10 ill ;模板1 ill。94°C 预变性 5min，94°C 变性 lmin，56°C 退火 2min，72°C 延伸2min，35个循环，72°C延伸lOmin，4°C保存。PCR扩增产物用I %琼脂糖凝胶电泳进行检测，90V，30min ；EB染色30min，检测扩增产物。扩增产物纯化后连接到pMD19_T载体，转化于 Escherichia coliDH5 a ,提取阳性克隆质粒,委托TaKaRa公司测序,提交NCBI (National Center for Biotechnology Information)进行比对。与登录号为 DQ903178. I 的 Bacillus axarquiensis strain LMG 22476DNA gyrase subunit B(gyrB)基因比对，相似度为99%， 因此鉴定 1JN2 为 Bacillus axarquiensis。实施例2蜡质芽孢杆菌1JN2生防菌剂的制备将上述防治西瓜细菌性果斑病的生防菌株1JN2(CGMCC NO. 5731)在LB培养液 280C 180rpm振荡培养12_16h，然后6000rpm离心lOmin，用灭菌水进行稀释制成菌剂，菌剂成品中活菌总浓度为I X IO9-I X 101(lCFU/mL，以下称该生防菌剂为蜡质芽孢杆菌1JN2生防菌剂。实施例3蜡质芽孢杆菌1JN2温室促生试验将催芽后的西瓜种子播种于装有无菌土壤中盆砵中，每盆一粒，16/8h光周期。待西瓜长到6叶期时，将悬浮好的蜡质芽孢杆菌1JN2生防菌剂(实施例2制备，下同)以 108CFU/ml的浓度用手动式喷器将该菌成雾状喷施于叶片的表面，使叶片湿润而菌剂又恰好不流下来。置于温室中培养，28°C，70%相对湿度以上，生防菌接种30天后，分别取处理组和对照组植株，小心剔除根部土壤，清洗干净后，自然风干，分别统计地上部长，地下部长，植株鲜重。6CTC,烘干72h后测量植株干重。生物量增加(％ )=(处理组植株干重-对照植株干重)/对照植株干重X 100 %表2. Bacillus axarquiensis 1JN2对西瓜苗期的促生作用
权利要求
1.一种防治西瓜细菌性果斑病的生防菌株1JN2，分类命名为Bacillus axarquiensis,于2012年I月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCN0. 5731。
2.用权利要求I所述的保藏号为CGMCCNO. 5731生防菌株1JN2制备的生防菌剂。
3.权利要求I所述的保藏号为CGMCCNO. 5731生防菌株1JN2在防治西瓜细菌性果斑病中的应用。
4.权利要求I所述生防菌株1JN2用于制备生防菌剂的方法，其特征在于将权利要求I所述防治西瓜细菌性果斑病的生防菌株1JN2在LB培养液中28°C 180rpm振荡培养 12-16h，然后6000rpm离心lOmin，用灭菌水进行稀释制成菌剂，菌剂成品中活菌总浓度为 lX109-lX101QCFU/mL。
5.权利要求2所述生防菌剂在防治西瓜细菌性果斑病中的应用。
全文摘要
本发明属于农作物防病治病技术领域，公开了防治西瓜细菌性果斑病生防菌株1JN2及其应用。生防菌株1JN2，分类命名为Bacillus axarquiensis，2012年1月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.5731。将该菌在LB培养液中28℃180rpm振荡培养12-16h，然后6000rpm离心10min，用灭菌水进行稀释制成菌剂，菌剂成品中活菌总浓度为1×109-1×1010CFU/mL。温室大棚试验结果显示，含1JN2的生防菌剂对西瓜的促生作用效果显著，生物量增加达到55.92％，并且该生防菌剂对西瓜果斑病病害防效显著，高达50.13％。
文档编号A01P1/00GK102604869SQ20121007933
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月23日 优先权日2012年3月23日
发明者武芳, 蒋春号, 郭坚华 申请人:南京农业大学