瓜类细菌性果斑病免疫层析检测试条的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种检测瓜类细菌性果斑病的器具，特别是涉及一种瓜类细菌性果斑病的免疫层析检测试条。
【背景技术】
[0002]瓜类细菌性果斑病病原为嗜酸菌属西瓜亚种(Acidovorax avenae subsp.citrulli)，病菌菌体短杆状，革兰氏染色阴性，不产生荧光，严格好氧，单根极生鞭毛；能在41°C下生长，不能在4°C下生长；在KB培养基上呈现乳白色、圆形、光滑、全缘、隆起、不透明菌落，菌落直径I?2mm。该病菌引起烟草过敏反应结果不一致，不产生精氨酸水解酶，明胶液化力弱，氧化酶和2 —酮葡糖酸试验阳性。该病菌可附着在西、甜瓜种子表面，也可能侵入种子的内部组织，存活于种皮下的胚乳表层，在种子中的存活时间长，抗逆能力强。带菌种子为初次感染源，种子发芽后感染子叶和真叶，借助雨水、灌溉、田间操作使病菌自然接种到同株叶片或邻近的植株上而传播，幼果受感染后病斑不明显，但到果实成熟前病斑迅速扩大而失去商品价值，对西、甜瓜生产造成难以挽回的损失。
[0003]瓜类细菌性果斑病为典型的种传病害，从苗期到成株期均可发生，病果、病株、染病果皮及接触带菌果实的健康果实都会成为菌源，具有潜伏时期长、传播快和不易识别等特点，对西、甜瓜的种植造成巨大的威胁。现在该病已成为瓜类作物一种严重的世界性病害，在美国、澳大利亚、巴西、土耳其、泰国、以色列等国家和我国河北、山西、新疆、河南等多个省份和地区发生，因此我国也将细菌性果斑病定为检疫对象，进口或引种时应严格进行种子检疫。国内瓜类细菌性果斑病的检测方法主要有血清学检测和分子检测，血清学检测主要有ELISA法，其缺点是检测精度低、假阳性高，分子检测有免疫检测、PCR法、荧光定量PCR等，其优点是灵敏、准确、快速，缺点是对实验技术要求较高，对技术设备且需特定的仪器设备和专业技术人员。以上这些方法虽然有各自的优点，但是也都存在着明显的缺陷，很难在基层生产上推广。因此，瓜类细菌果斑病检测如何向快速、简便、高效又能够在基层广泛使用成为了亟待解决的问题。
【发明内容】
[0004]针对上述问题，本发明提供了一种特异、快速、简便的瓜类细菌性果斑病免疫层析检测试条，该检测试条应用范围广，便于推广应用，能够在基层地区广泛使用。
[0005]为解决上述问题，本发明通过以下技术方案实现:
设计一种瓜类细菌性果斑病的免疫层析检测试条，包括置于最下层的支撑底板，提供整个产品骨架，依次连接设置于该支撑底板上的样品缓冲层、覆载有标记蛋白的承载层、包被吸附层和液体吸收层，且在所述包被吸附层上设有至少一条测试线和质控线。
[0006]根据上述的免疫层析检测试条，所述标记蛋白为抗细菌果斑病单克隆抗体IgG，所述测试线对应地由兔抗细菌果斑病多克隆抗体IgG制成；或者所述标记蛋白为兔抗细菌果斑病多克隆抗体IgG，所述测试线对应地由抗细菌果斑病单克隆抗体IgG制成。
[0007]根据上述的免疫层析检测试条，所述测试线的制成方法如下:用生理盐水将抗细菌性果斑病单克隆抗体IgG或兔抗细菌果斑病多克隆抗体IgG配制成0.5?10mg/mL的溶液，再用单向喷点仪将该溶液按照0.5?1.5PL/cm的用量喷射在包被吸附层上，形成测试线。
[0008]根据上述的免疫层析检测试条，所述标记蛋白采用量子点标记法进行标记，且用于量子点标记的材料采用以下方法制备:选用Cd或Zn作为阳离子前驱体，Se或Te作为阴离子前驱体，以多官能团巯基小分子巯基乙酸、巯基丙酸、谷胱甘肽或半胱氨酸作为保护剂，通过加热回流三者混合溶液使量子点逐渐成核并生长，即得。
[0009]根据上述的免疫层析检测试条，所述标记蛋白在承载层上覆载方法如下:将量子点标记蛋白的重悬液用缓冲液稀释2倍，然后用单向喷点仪将其按照3?15PL/cm的用量喷射在承载层上，且使其喷到承载层上后能扩散成2?8mm宽，然后45°C鼓风干燥I小时后，即成；所述缓冲液含 100mmol/L ρΗ8.0 Tris_HCl、5wt% BSA、0.lwt% Triton X-100、5wt%鹿糖。
[0010]根据上述的免疫层析检测试条，所述质控线由抗种属特异性二抗IgG制成。
[0011]根据上述的免疫层析检测试条，所述质控线经由以下方法制成:用单向喷点仪将兔抗鼠或羊抗兔二抗蛋白按照0.5?1.5PL/cm的用量喷射在包被吸附层上形成对应的质控线。
[0012]根据上述的免疫层析检测试条，所述支撑底板由不吸水的硬质纸条或PVC材料制成，且其一面带有胶水涂层；所述包被吸附层由硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、混合纤维素膜、FUS1N 5、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成；所述承载层由玻璃纤维膜、FUS1N 5或聚酯膜制成；所述液体吸收层由吸水纸、FUS1N 5或吸水纤维制成；所述样品缓冲层由玻璃纤维膜、FUS1N 5或聚酯膜制成。
[0013]根据上述的免疫层析检测试条，所述免疫层析检测试条的外部还设有保护材料层，由塑料胶膜或成型塑料制成。
[0014]根据上述的免疫层析检测试条，所述测试线和质控线的组合排列为“ I I ”、“..”或“+”形式。
[0015]本发明的积极有益效果:
(I)结果直观、可分级定量:本发明检测试条以鲜艳的红色或橙色(需在紫外光源激发下观测)“ I I ”、“..”或“+”等形式的印迹线作为结果显示，出现的检测线强度在一定范围内与被测样品中细菌性果斑病病原菌含量高低密切相关，结果判定直观准确。
[0016](2)操作简便、快速:使用本发明检测试条时无需任何其它试剂，只要将其插入用稀释液稀释好的待检样品中10秒左右，在10分钟内即可在紫外光源激发下观测判定检测结果。不需另配仪器设备及其它试剂，随时随地进行检测，费用低廉，可节省大量贵重仪器及设备费用。
[0017](3)特异性强:本发明以量子点标记细菌性果斑病单克隆抗体(或多克隆抗体)，测试线为细菌性果斑病多克隆抗体(或单克隆抗体)为基础制备而成，因此就保证了该免疫层析检测试条的反应特异性。
[0018](4)应用范围广，便于推广应用:本发明检测试条操作简单，不需要专业技术人员操作，按照使用说明人人可以操作，包括植物检疫、种植合作社到个体种植等，具有广阔的市场前景和较好的经济、社会效益。
【附图说明】
[0019]图1为本发明瓜类细菌性果斑病免疫层析检测试条的结构示意图。
[0020]图2为本发明瓜类细菌性果斑病免疫层析检测试条的俯视图。
[0021]图中，1:样品缓冲层，2:包被吸附层，3:液体吸收层，4:支撑底板，5:承载层，6:质控线，7:测试线。
【具体实施方式】
[0022]制备本发明瓜类细菌性果斑病免疫层析检测试条，首先需制备量子点标记的细菌性果斑病单克隆抗体IgG或多克隆抗体IgG，配合抗体测试线的细菌性果斑病多克隆抗体IgG或单克隆抗体IgG，从而制备蛋白标记承载材料层和测试线及质控线。
[0023]1.细菌性果斑病细菌的培养
细菌性果斑病Pslb-86菌株为中国农业科学院植物保护研宄所赵廷昌研宄员提供，菌株采样地点为新疆(2003年6月)，寄主作物甜瓜，经常规方法纯化后置于取_80°C保存。
[0024]培养皿用报纸包起来，灭菌；取_80°C Pslb-86甘油菌株，将灭菌后的培养基倒入平板中，琼脂凝固后，倒置；接种环在酒精灯的火焰上烧红后，降温，取一环菌，在平板上划线；划线后的平板，倒置放入培养箱中进行活化培养；经LB固体平板37°C活化培养24?48h，接种于LB液体培养基中，于37° C震荡培养18h，获得菌液。
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