专利名称：瓜类果斑病菌检测用引物探针及其检测方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测瓜类果斑病菌的引物探针及其检测方法，属生物技术领域。
背景技术：
瓜类果斑病是葫芦科作物上的一种严重的世界性病害，其病原为嗜酸菌属西瓜种 (Acidovorax citrulli)。瓜类果斑病菌可侵染多种葫芦科作物,如西瓜、甜瓜、南瓜、黄瓜等。自报道发生 以来已在美国、澳大利亚、中国等很多国家发生，给当地的西甜瓜种植业造成了严重损失。该病菌可通过种子进行远距离传播，为我国进境植物检疫性有害生物。
健康种子是该病害防控最重要及最有效的手段，快速准确的检测技术是保证种子健康的重要措施。传统的检测技术主要包括分离培养、过敏性坏死反应、生理生化测定、免疫学检测及种植观察等。该类方法耗时长且灵敏度不高，难以满足检疫要求。分子生物学检测方法目前在该病原菌的检测中已广泛应用。Walcott等报道了利用WFB1/WFB2引物对进行PCR凝胶电泳检测的方法，该对引物扩增效率及灵敏度较高，在检测中应用比较广泛， 但缺点是特异性差，不能将瓜类果斑病菌与嗜酸菌属的很多其它种区分开，容易导致假阳性结果。而且PCR电泳方法容易导致PCR产物污染，在专业的检测实验室中不太适用。胡白石等建立了该病原菌padlock探针检测技术，有效避免了 PCR检测方法易受样品杂质干扰及假阳性问题，具有很高的特异性及灵敏度。实时荧光PCR技术在封闭管中进行PCR扩增及检测，具有PCR凝胶电泳技术不可比拟的优势，避免了 PCR产物污染，而且具有更高的灵敏度与特异性，目前在病原菌检测中已广泛应用。在瓜类果斑病菌检测中实时荧光PCR 方法报道也比较多，通过实验室实验验证比较，在特异性灵敏度及广谱性(对不同来源瓜类果斑病菌的检测)等几个指标方面难以顾全。
本研究通过比较已报道的瓜类果斑病菌的基因组与其近缘种之间的差异，找出特异性序列并设计引物探针，建立了瓜类果斑病菌实时荧光PCR检测方法。本发明灵敏度高， 准确性可靠，为该病害的田间监测及口岸检疫提供技术支撑。发明内容
本发明目的在于提供用于瓜类果斑病菌实时荧光PCR检测的引物探针序列及其检测方法。
本研究通过比较已报道的瓜类果斑病菌的基因组与其近缘种之间的差异，找出特异性序列并设计引物探针，筛选比较后建立了瓜类果斑病菌实时荧光PCR检测方法。
所述的引物对由正向和反向引物组成，其核苷酸序列如序列表Seql和Seq2所示； 所述探针核苷酸序列如序列表Seq3所示，该探针一端标记有报告荧光基团。另一端标记非荧光性的淬灭基团。
本发明还进一步给出了应用上述引物和探针的荧光PCR检测方法，其以样品总 DNA为模板，进行实时荧光PCR扩增，每个循环结束采集荧光信号，反应结束后根据扩增曲线判定结果。
具体地说本发明以样品总DNA为模板，进行实时荧光PCR反应，即在25 μ L反应体系中加入12.5yL 2X荧光PCR反应预混液，I μ L弓丨物Seql (10 μ mol/L)，I μ L弓丨物Seq2 (10 μ mol/L), O. 5 μ L TaqMan 探针 Seq3 (10 μ mol/L), I μ L DNA,补充超纯水至 25 μ I
其中，上述反应条件可以是第一个循环为95 °C IOmin;随后40个循环，940C 15s, 58°C Imin0
进一步，还可以将本发明引物、探针以及相关试剂组装成试剂盒，以方便使用。
图I是实时荧光PCR方法特异性实验结果；A:瓜类果斑病菌，B:其他对照细菌及空白对照。
图2是实时荧光PCR方法灵敏度实验结果。I 8 X IO6CFU/ μ L, 2 8 X IO5CFU/ μ L, 3 8 X IO4CFU/μ L, 4 8 X IO3CFU/μ L, 5 8 X IO2CFU/μ L 1,6 8 X IO1CFU/μ L, 7 8 X IO0CFU/ μ L，8 0. 8CFU/y L,9 :空白对照。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均来自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例I引物及探针的设计和合成
本研究通过分析已报道的瓜类果斑病菌的基因组序列,利用软件primer Express 3. O设计引物及探针，最后经过比较筛选确定的引物序列为
Seql 5/ -CTGATAATCCTCGGCTCAACAA-3'，
Seq2 5/ -TGAGCGCATTTCTGACGAG-3'，
探针序列为Seq3:5' -AAGAAATACGCCCTCGCCAATCTCC-3'，
该探针5'端标记报告荧光基团，3'端标记非荧光淬灭基团。
实施例2实时荧光PCR检测方法的建立
在25yL反应体系中加入12.5yL 2X荧光PCR反应预混液，I μ L引物Seql (10ymol/L)，lyL 引物 Seq2 (10 μ mol/L), O. 5 μ L TaqMan 探针 Seq3 (10 μ mol/L), I μ L DNA，补充超纯水至25 μ I。将样品管放入ABI 7900荧光PCR仪后，设置如下条件进行反应 第一个循环为95°C IOmin;随后40个循环，94°C 15s, 58°C lmin。每个循环采集荧光信号， 反应结束后根据扩增曲线判定结果。
实施例3实时荧光PCR方法的特异性实验
以瓜类果斑病菌及其近缘种为对象，测试该方法的特异性。所用近缘种包括了嗜酸菌属 A. avenae subsp. aveane, A. avenae subsp. cattleyae, A. konjaci 及其他属 23 株植物病原菌及10株不同来源的瓜类果斑病菌。实验中直接以浓度为106CFU/mL左右的菌液 I μ I为模板进行实时荧光PCR反应，结果表明所有瓜类果斑病菌株均为阳性(图I中A标识的曲线)其他的非瓜类果斑病菌(图I中B标识的曲线)均为阴性结果。证明了该方法具有较好的特异性。
实施例4实时荧光PCR方法灵敏度实验
利用平皿涂板培养计数法对液体培养至对数生长期的瓜类果斑病菌进行浓度测定，利用超纯水进行IOX梯度稀释，稀释后浓度分别为8 XlO6CFU/^ I至O. 8CFU/y 1，分别取I μ I稀释液作为模板进行实时荧光PCR灵敏度实验。检测结果如图2所示，8CFU/μ I浓度以上均获得强的荧光信号(图2中1-7)，故最低检测限是SCFU/μ I。
实施例5对西瓜种子的检测
实验用种子为根据标准(SN/T1465-2004)检测确认的8份携带瓜类果斑病菌，4份不携带瓜类果斑病菌的西瓜种子。每份种子取100g，4°C无菌水浸泡过夜后取5ml浸泡液， IOOOOg离心lOmin，取沉淀利用商业化DNA提取试剂盒提取总DNA。通过实时荧光PCR检测， 携带瓜类果斑病菌的种子样品均可观察到明显的荧光信号，而不携带瓜类果斑病菌的西瓜种子及空白对照的荧光信号无明显变化，验证了该方法的可靠性，可应用到实际检测。
权利要求
1.一种瓜类果斑病菌检测用引物，其核苷酸序列为Seql 5/ -CTGATAATCCTCGGCTCAACAA-3'，Seq2 5/ -TGAGCGCATTTCTGACGAG-3'。
2.一种与权利要求I所述引物配合使用的探针，其核苷酸序列为Seq3 -AAGAAATACGCCCTCGCCAATCTCC-3'，该探针 Y 端标记报告荧光基团，3'端标记非荧光淬灭基团。
3.一种利用权利要求I的引物及权利要求2的探针进行瓜类果斑病菌实时荧光PCR检测的方法，其特征在于实时荧光PCR反应的退火温度为58°C。
全文摘要
本发明提供了一种瓜类果斑病菌检测用引物及探针，所述引物的核苷酸序列如序列表Seq1&Seq2所示，所述探针的核苷酸序列如序列表Seq3所示。本发明还进一步提供了瓜类果斑病菌检测方法，该方法以样品总DNA为模板，利用上述引物和探针进行实时荧光PCR扩增，每个循环采集荧光信号，反应结束后根据扩增曲线判定结果。本发明探针特异性好，检测方法快速简单，准确性高，灵敏度高，为保证瓜葫芦科种子健康提供了技术支撑。
文档编号C12Q1/68GK102925568SQ20121040811
公开日2013年2月13日 申请日期2012年10月24日 优先权日2012年10月24日
发明者田茜, 赵文军, 牟海青, 朱水芳 申请人:中国检验检疫科学研究院