一种检测水稻白叶枯病菌的hda试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测水稻白叶枯病菌的HDA试剂盒及检测方法，属于检验检疫领 域。 技术背景
[0002] 水稻是世界最重要的粮食作物之一，全球约有一半人口以水稻为主食。水稻白叶 枯病，又称白叶瘟、茅草瘟、地火烧等，是水稻最主要病害之一，对水稻产量造成了严重的影 响。该病由细菌引起，病原菌为水稻黄单胞菌dMdomwas orjzae)。2007年，农业部会同 国家质量监督检验检疫总局共同制定了《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》， 该目录将水稻白叶枯病明确列为水稻的检疫性病害。重视并加强水稻白叶枯病菌的检验检 疫工作，对切实保障水稻的安全生产有着重要意义。
[0003] 根据《中华人民共和国出入境检验检疫行业标准》中关于水稻白叶枯病菌的检测 方法规定，对于出入境种子首先需要进行样品的清洗、研磨并获得提取液，然后进行平板培 养，或利用ELISA试剂盒对提取液进行快速筛选检测。对于检测结果呈阳性的还需进行进 一步的平板分离和生化鉴定。整个过程程序复杂，耗时长，且在操作过程中可能产生假阳性 或假阴性结果。随着分子生物学技术的发展，以聚合酶链式反应（PCR)为依托的检验方法 已应用于水稻白叶枯病的检测，该方法虽然灵敏准确，但需要高品质热循环仪，成本较高， 难以大范围应用在基层单位的日常检验检疫工作中，而且，PCR反应温度循环的过程导致了 反应时间较长，增加了检验的时间成本。因此，有必要开发一种更加准确、快捷、成本低、简 单易操作的检测水稻白叶枯病菌的方法。
[0004] 依赖解旋酶 DNA 等温扩增技术（Helicase-Dependent isothermal DNA Amplification，简称HDA)是由美国NEB公司于2004年开发的一种核酸等温扩增技术。该 技术只需在恒定温度下进行，不需要温度变化的过程，因此，在实际操作和仪器要求方面， HDA技术都比PCR技术更为便捷和廉价，真正使样品的检测实现了快速、简便和低成本，从 而更容易被开发出检测的应用产品。
[0005] HDA技术原理是利用解旋酶在恒温条件下解开DNA双链，同时DNA单链结合蛋白 (SSB)稳定解开的单链为引物提供结合模板，然后由DNA聚合酶催化合成互补链，新合成的 双链在解旋酶的作用下又形成单链，并作为下一轮合成的模板进入循环扩增反应，最终实 现靶序列的指数增长。该技术的优点在于：等温扩增，HDA技术在一个恒定温度就能完成扩 增反应，不需要像普通PCR那样循环的温度变化，可以减少扩增时间；设备简单，HDA反应不 需要复杂和昂贵的热循环仪设备，只需要一个简单的恒温器就可进行。因此，HDA技术有望 成为一种重要的检验检测工具。
[0006] 目前，国际上对于HDA技术的研究和应用尚处于起步阶段，国内外还没有关于HDA 法检测水稻白叶枯病菌的研究。我们将首次提供快速检测水稻白叶枯病菌的HDA试剂盒， 并建立起相应检测方法。该发明是水稻白叶枯病菌检测技术体系的进一步完善和发展。该 方法的建立，将使得水稻白叶枯病菌的检测真正实现准确、快捷、成本低和简单易操作，特 别适用于在基层单位的日常检验检疫工作中大范围推广，可为我国的水稻白叶枯病的有效 防治做出贡献。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是针对现有检测技术的不足，提供一种更加准确、快捷、成本低和简 单易操作的检测水稻白叶枯病菌的HDA试剂盒及检测方法。
[0008] -、本发明所述检测水稻白叶枯病菌的HDA试剂盒包括：一对特异性检测水稻白 叶枯病菌的HDA引物对（即SEQIDNo:1 和SEQIDNo:2)、10X 缓冲液、ATP、dNTPs、Bst polymerase、RecA蛋白、UvrDhelicase、阳性对照DNA和ddH20 ; 所述HDA引物对序列为： SEQ ID No ：1 ：5, -CTCGGCAAGAAGAAGCAGTC-3,； SEQ ID No :2 :5' -TAACTGCTGGCAATGATCCG-3'。
[0009] 二、本发明所述检测水稻白叶枯病菌的检测方法为： (1) 从待测样本中提取DNA作为检测模板：采用细菌DNA提取试剂盒提取待测样本 DNA，保存备用； (2) 利用本发明所提供的HDA试剂盒，进行HDA反应，得到扩增产物； 所述的HDA反应体系为：5 y L的10 X缓冲液，0. 2 y mol的ATP，0. 1 y mol的dNTPs，10U Bst polymerase，2-5 yg RecA 蛋白，0.2-0. 4 yg UvrD helicase，2 yL 的 10 ymol/L 的上 游引物，2yL的lOymol/L的下游引物，2yL的样品基因组DNA，用ddH20补至50yL ; 所述的HDA反应方法为：将反应体系放入60-70°C恒温水浴锅中恒温扩增90-120min ; (3) 检测扩增产物，并作出判断 所述的检测扩增产物并作出判断是采用琼脂糖凝胶电泳的方法进行，出现281bp的特 异性扩增条带即判断为检测出水稻白叶枯病菌。
[0010] 作为上述HDA试剂盒的一种优选技术方案，10 X缓冲液包括100mM二硫苏糖醇、 350mM Tris-HAc、100mM MgS04、lmg/mL BSA 和 25yM 海藻糖，此方案简化了 HDA 反应过程， 也节省了试剂盒空间。
[0011] 作为上述HDA反应体系的一种优选技术方案，反应体系中RecA蛋白的含量为 3 yg〇
[0012] 作为上述HDA反应体系的一种优选技术方案，反应体系中UvrDhelicase的含量 为 0? 3 yg。
[0013] 作为上述HDA反应方法的一种优选技术方案，将反应体系放入65°C恒温水浴锅中 恒温扩增l〇〇min。
[0014] 本发明的有益效果为：所开发的HDA检测法具有极高的特异性，仅能从水稻白叶 枯病菌DNA中扩增出特异性条带，较生理生化检测法具有更高的灵敏度和准确性；所提供 的HDA检测法在恒温下就能进行，反应温度不需要循环变化，较常规PCR检测法速度更快； 扩增反应只需要普通水浴锅就可以进行，不需要复杂和昂贵的热循环仪设备。因此，该发明 是水稻白叶枯病菌检测技术体系的进一步完善和发展，使得水稻白叶枯病菌的检测真正实 现准确、快捷、成本低和简单易操作，特别适用于在基层单位的日常检验检疫工作中大范围 推广。
【附图说明】
[0015] 图1为本发明HDA法检测不同小种的水稻白叶枯病菌试验结果图，其中，M:DNA marker；1~11iXanthomonas oryzaepv.oryzaeYNUYN1UYN18>YN24>PX0347>PX0349> PX0364、0S86、0S198、0S225、ZHE173 ;12 :阳性对照；13 :阴性对照。
[0016] 图2为本发明HDA法检测水稻其他病原菌和其他植物病原菌的试验结果图。其 今M.SMk位^(\&〇，\-\2 \Xanthomonas oryzae pv. oryzicola RH3、RS85、RS105、HNB8-47、 PX071、PX086、PX099、AHB4-75、JSB2-24、JSB3-22、YNB10-32、SCB4-l'Yi ?? Xanthomonas axonopodispv.citriYC；14iXanthomonas campestrispv.campestrisX8-1 ； 15-16 ： Ustilaginoidea oryzaeLN>SX0201 ；17-.Xanthomonas maltophi：Burkholderia gladiolipv.alliicola；19-.Burkholderia cepacia\2Q：Burkholderia glumae\2\： 2 2 :阳性对照；2 3 :阴性对照。
【具体实施方式】
[0017] 下面将结合实施例对本发明作进一步详细的说明。本发明实施例中所使用的实验 方法如无特殊说明，均为本领域内常规方法。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以 通过商业途径获得的常规产品。
[0018] 1.HDA引物对的设计： 在GenBank数据库中搜索水稻白叶枯病菌（yTanMomwas. pv. 基因序 列并利用NCBI中的BLAST工具根据进行nucleotideblast比对，获得水稻白叶枯病菌特异 性的糖基转移酶基因(yXrcasjiiraas/krase(GenBank号为：AF169030. 1)。引物的设计经 过同源性对比，选取特异性较高的区域设计扩增引物对，用于增加检测的准确度与特异性。 经过对设计引物的筛选，最终确定了一对效果最佳的引物对用于本发明，命名为Xoo-JYF 和Xoo-JYR(即SEQIDNo:1和SEQIDNo:2)〇
[0019] 2.引物对的合成和试剂盒的制备： 根据所设计引物的核苷酸序列信息由上海生工生物工程有限公司合成引物对； 将上述合成好的引物对分别配制成浓度为10Mffl〇l/L的溶液作为试剂盒，备用。试剂盒 还内含：l〇X缓冲液，ATP，dNTPs，Bstpolymerase，RecA蛋白，UvrDhelicase，阳性对照 DNA和 ddH20。
[0020] 3.样品基因组DNA的提取： 实施例中所用不同小种的水稻白叶枯病菌（yTandomwas orjzae1 pv.oryzaeYNU YN11、YN18、YN24、PX0347、PX0349、PX0364、0S86、0S198、0S225、ZHE173)和其他病原菌 {Xanthomonas oryzae pv. oryzicola RH3、RS85、RS105、HNB8-47、PX071、PX086、PX099、 AHB4-75、JSB2-24、JSB3-22、YNB10-32、SCB4-U Xanthomonas axonopodis炉.citriYC； Xanthomonas campestrispv.campestrisX8-1\Ustilaginoidea oryzaeLN、SX0201; Xan thomona