疣粒野生稻抗白叶枯病基因Me094及其应用的制作方法

文档序号:495435
疣粒野生稻抗白叶枯病基因Me094及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种疣粒野生稻抗白叶枯病基因Me094及其应用。所述基因Me094的cDNA全长的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:1所示。本发明首次克隆出疣粒野生稻抗白叶枯病基因Me094,并获得转Me094基因植株。该基因在疣粒野生稻中属于诱导型表达,转入栽培稻后可显著提高其对白叶枯病的抗性。本发明发掘的疣粒野生稻抗白叶枯病基因Me094对培育高抗白叶枯病水稻具有重要的实际及理论意义,对其他植物对白叶枯病害的防治也具有指导作用。
【专利说明】疣粒野生稻抗白叶枯病基因 Me094及其应用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学【技术领域】,具体涉及一种由疣粒野生稻中克隆的抗白叶枯 病的新基因。

【背景技术】
[0002] 白叶枯病由革兰氏阴性菌黄单孢水稻变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)引起的的细菌性病害,最早是1884年在日本福岗地区发现。20世纪50年 代以来,白叶枯病发病范围逐步扩大,目前已遍及世界各水稻产区。由于其危害严重,化学 防治不仅污染周边环境,还难以奏效,因此,选育带有主效抗病基因的品种已经成为控制水 稻白叶枯病经济有效的方法。
[0003] 水稻白叶枯病抗病基因发掘与鉴定是开展抗白叶枯病育种的重要基础。目前,人 们在抗白叶枯病基因发掘上已取得显著的成果,截至2013年3月,经国际注册确认和期刊 报道的水稻白叶枯病抗性基因共38个。其中26个为显性基因 Xa,其它为隐性基因 xa ;已 被定位的抗性基因有26个,并且Xal、xa5、xal3、Xa21、Xa23、Xa26、Xa27等7个基因已成功 克隆。但是,随着育种家对栽培稻品种的长期选育和广泛推广,品种遗传背景日益狭窄,力口 之白叶枯菌生理小种不断进化,导致了一些携带较窄抗谱抗病基因的品种逐渐退化。因此, 发掘和鉴定新的抗白叶枯基因对水稻白叶枯病的防治有着十分重要的意义。
[0004] 野生稻由于长期生长在各种逆境中,已经积累了很多优良的基因,研究结果表明, 野生稻中抗病虫害的检出率大约是栽培稻的50倍,所以,从野生稻中挖掘有利基因用于栽 培稻的遗传改良具有十分重要的意义。在已被鉴定出的38个水稻抗白叶枯病基因中,其 中有7个来自于野生稻,即显性基因 Xa21、Xa23、Xa27、Xa29、Xa30、Xa32和隐性基因 xa32。 Xa21是第一个从野生稻中被克隆出来的重要功能基因,Khush等报道其源自西非长药野生 稻(Oryza longistaminata) (Khush 等,Rice Gene Newslett, 1990, 7:121-122),在水稻分 蘖后期抗当时菲律宾的全部6个小种。显性基因 Xa23、Xa27、Xa29、Xa30、Xa32分别来自于 普通野生稻、小粒野生稻、药用野生稻、普通野生稻和澳洲野生稻,隐性基因 xa32源自疣粒 野生稻。
[0005] 据程在全等报道(程在全等,植物病理学报,2008, 38:582-591),云南现存疣粒野 生稻(Oryza meyeriana)居群37个,且大多数居群对白叶枯病都有很强的抗性,甚至还有 免疫的。但是,通过设计已知基因序列的引物对不同居群扩增抗病基因或同源片段都未扩 增出目前已知已经报道的抗白叶枯病基因 Xa21和Xal,因此,推测高抗疣粒野生稻中可能 含有多个尚未分离克隆的抗白叶枯病新基因。另外,阮辉辉等报道的xa32属于隐性基因且 尚未被克隆(阮辉辉等,西北农业学报,2008, 17 (6) : 170-174)。
[0006] 本发明所述的疣粒野生稻抗白叶枯病基因 Me094编码金属硫蛋白。目前,已成功 克隆了多个植物金属硫蛋白基因,有些研究结果发现,植物的衰老、机械伤害和病原物的侵 染能诱导金属硫蛋白的表达。如有研究认为烟草中的金属硫蛋白基因表达受机械伤害和 烟草花叶病毒的诱导而过量表达。当植物受到机械伤害和病原物的侵染时,植物遭受到氧 化胁迫时就会通过产生反应氧以增强植物的抗病性和阻止病症的进一步扩展,同时认为被 诱导的金属硫蛋白可以降低细胞内的自由金属离子浓度同时阻止被胁迫植物增加反应氧。 当植物受到病原物的侵染时,由于植物体内大分子物质的降解而导致许多酶释放出金属离 子,在这个过程中金属硫蛋白的作用是将释放出来的金属离子从感染的部位分离并运输到 植物发育的组织中。有关水稻金属硫蛋白的研究已有少量报道,目前己获得的金属硫蛋白 基因序列对研究疣粒野生稻细胞内的基因表达调控作用、抗病机制提供了依据,同时对病 原早期的抗病反应、激活细胞内一些防卫基因的表达等各方面的研究也提供了很好的研究 基础。


【发明内容】

[0007] 本发明目的是为解决抗白叶枯病的品种逐渐退化问题,提供一种疣粒野生稻抗白 叶枯病的新基因 Me094及其在水稻抗病中的应用或应用于改良其他植物抵御病害的能力。
[0008] 本发明所提供的一种疣粒野生稻抗白叶枯病基因 Me094的cDNA全长的核苷酸序 列如序列表中SEQ ID NO :1所示。
[0009] 所述的疣粒野生稻抗白叶枯病基因 Me094的CDNA片段赋予植物对由白叶枯病菌 (Xanthomonas oryzae pv.oryzae, Xoo)引起的病害产生抗病反应。所克隆的Me094抗白叶 枯病基因编码金属硫蛋白。这种蛋白质富含半胱氨酸,其主要作用是参与植物中微量元素 的储存、运输和代谢、重金属的解毒、自由基的清理以及增强机体的免疫力和抗应激等,同 时还参与植物的胁迫保护反应过程。
[0010] 本发明还提供了所述疣粒野生稻抗白叶枯病基因 Me094在水稻抗白叶枯病中的 应用。
[0011] 与现有技术相比,本发明的有益效果是:
[0012] 本发明首次克隆出疣粒野生稻抗白叶枯病基因 Me094,并获得转Me094基因植株。 该基因在疣粒野生稻中属于诱导型表达,转入栽培稻后可显著提高其对白叶枯病的抗性。 本发明发掘的疣粒野生稻抗白叶枯病基因 Me094,通过遗传转化获得的转Me094基因水稻, 主要用于抗白叶枯病水稻育种,避免白叶枯病细菌病害的危害,对培育高抗白叶枯病水稻 具有重要的理论及实际意义,对其他植物白叶枯病害防治也具有指导作用。
[0013] 序列表中SEQ ID NO :1所示的是本发明疣粒野生稻抗白叶枯病基因 Me094的cDNA 全长的核苷酸序列。
[0014] 序列表中SEQ ID NO :2所示的是疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因 Me094编码的氨 基酸序列。
[0015] 序列表中SEQ ID NO :3所示的是Me094的EST序列上游引物Me094-E(+)的碱基 序列。
[0016] SEQ ID NO :4所示的是Me094的EST序列下游引物Me094-E(_)的碱基序列。
[0017] SEQ ID NO :5所示的是接头引物Ap-dT的碱基序列。
[0018] SEQ ID NO :6所示的是Me094的ORF序列上游引物Me094-F(+)的碱基序列。
[0019] SEQ ID NO :7所示的是Me094的ORF序列下游引物Me094-F(_)的碱基序列。
[0020] SEQ ID NO :8所示的是Me094基因的3'端核苷酸序列。
[0021] SEQ ID NO :9所示的是Me094基因的5'端核苷酸序列。
[0022] SEQ ID NO :10所示的是疣粒野生稻抗白叶枯病基因 Me094的EST序列。

【专利附图】

【附图说明】
[0023] 图1 :含有Me094基因的表达载体pCAMBIA1300-BI_Me094图谱。
[0024] 图2 :转Me094基因水稻的DNA的PCR检测阳性植株图,图中M为DL2000Marker, 1为阳性对照,2为阴性对照,3-15为再生植株。
[0025] 图3 :Me094基因的半定量RT-PCR显示图。图中β-Acti是内参基因,CK、24h、48h、 72h、96h、120h分别为接无菌水对照、白叶枯病病原菌处理24h、48h、72h、96h、120h的cDNA 半定量RT-PCR的扩增结果。

【具体实施方式】
[0026] 下面结合具体实施实例,进一步阐述本发明。各实施例中无特殊说明为常规方法。
[0027] 试验材料:景洪抚粒野生稻(Oryza meyeriana)。白叶枯病病原菌Y8,白叶枯病病 原菌Y8为中国云南省典型的白叶枯病致病菌株,该菌株使用是利用其白叶枯病菌对水稻 的侵染能力的共性导致水稻叶片形成白叶枯病病斑,因此,使用其它具有白叶枯病致病能 力的各种白叶枯病菌菌株都能达到本发明的效果。以下各实施例所用试剂均为市售。
[0028] 实施例1 :抚粒野生稻抗白叶枯病基因 Me094表达序列标签的验证和表达分析
[0029] (1)材料的培养及处理
[0030] 景洪抚粒野生稻(Oryza meyeriana)栽于塑料大棚温室内,直至开花期。
[0031] 用NA培养基活化白叶枯病病原菌Y8,28°C培养2-3d,用无菌蒸馏水洗下菌苔,配 制成〇D_处值为0.6的菌液。下午15:00以后(该时段为白叶枯病病原菌感染能力最强) 以剪叶法接种于温室中的疣粒野生稻叶片,对照组用无菌水模拟接种,接菌后分别于24h、 48h、72h、96h、120h等量取样,对照即无菌水剪叶的疣粒野生稻也同时等量取样,取样后立 即把样品放入液氮中速冻,并放_70°C冰箱中保存。
[0032] (2)总RNA的提取、定量及检测
[0033] 总RNA的抽提采用TRIzol Reagent (美国Invitrogen公司)操作方法按公司提 供的试剂盒说明书进行。
[0034] 抽提完后,使用Fermentas公司的DNase I (RNase-free)去除总RNA中残留的基 因组DNA。随后取5 μ L总RNA测定其在260nm、280nm处的光密度及0D26Q/0D28Q的比值,估 计总RNA的纯度,再通过OD 26tl值对疣粒野生稻叶片的总RNA进行浓度计算。取3 μ L总RNA 在1 %琼脂糖凝胶上分离总RNA,检测总RNA的完整性。
[0035] (3)半定量RT-PCR分析
[0036] 取不同接菌时期的等量总RNA做反转录合成cDNA第一链,具体方法按照 TIANScript cDNA第一链合成试剂盒(北京天根生物技术有限公司)说明书操作。根据 Me094的EST序列设计Me094-E引物,以β -Actin基因作为内参基因进行不同时期的表达 分析。
[0037] Me094的EST序列上游引物Me094-E(+)的碱基序列如序列表中SEQ ID NO :3所 示,Me094的EST序列下游引物Me094-E(_)的碱基序列如序列表中SEQ ID NO :4所示。
[0038] 图3是Me094基因的半定量RT-PCR结果,结果显示Me094基因在疣粒野生稻中受 白叶枯病菌表达,且在120h内随着接菌时间的增长表达量也随着增加,这说明Me094可能 与疣粒野生稻抗白叶枯病有重要的关联。
[0039] 实施例2 :疣粒野生稻抗白叶枯病基因 Me094全长的克隆
[0040] 本发明中Me094基因全长的获得是通过3' RACE和5' RACE的方法。
[0041] 3'RACE以实施例1中提取的总RNA为模板,设计接头引物Ap-dT代替TIANScript cDNA第一链合成试剂盒中的Oligd(T)引物,其他操作与该试剂盒的说明书相同,将已扩增 的片段进行回收测序,从而获得Me094基因的3'端序列。接头引物Ap-dT的喊基序列如序 列表中SEQ ID NO :5所示。
[0042] 5' RACE的操作步骤参照大连宝生物工程有限公司5' RACE全长试剂盒进行操作, 从而犾得Me094基因的5'端序列。最后将Me094基因的5'端序列、3'端序列和基因 Me094 的EST序列拼接成一个完整的疣粒野生稻抗白叶枯病基因 Me094的cDNA全长序列如序列 表中SEQ ID NO :1所示。
[0043] Me094基因的3'端序列如序列表中SEQ ID NO :8所不。
[0044] Me094基因的5'端序列如序列表中SEQ ID NO :9所不。
[0045] 疣粒野生稻抗白叶枯病基因 Me094的EST序列如序列表中SEQ ID NO : 10所示。
[0046] Μθ094基因 EST序列的犹得:
[0047] 疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因 Me094的的EST序列是从已构建的疣粒野生稻受 白叶枯病菌诱导的抑制差减文库(SSH文库)中获得的,该SSH文库按照王天佐等人的方法 构建(王天佐等,干旱胁迫下黄花苜蓿与蒺藜苜蓿两个抑制性差减杂交文库的构建及分析 [J].草业学报,21 (6) : 175-181,2012),从构建好的SSH文库中随机挑选288条序列送到上 海生工生物工程有限公司进行测序,然后得到的序列在GenBank的非冗余核酸数据库中进 行Blast比对分析,得到与水稻金属硫蛋白基因同源性达到91 %的EST序列Me094。
[0048] 实施例3 :重组农杆菌的获得
[0049] (l)Me094基因的表达载体构建
[0050] 根据拼接的疣粒野生稻抗白叶枯病基因 Me094的cDNA全长序列设计包含完整 开放阅读框的Me094-F引物,设计时加入酶切位点,用于将Me094基因重组到表达载体 PCAMBIA1300 中。含有 Me094 基因的表达载体 pCAMBIA1300-BI-Me094 图谱见图 1。Me094 的ORF序列上游引物Me094-F(+)的碱基序列如序列表中SEQ ID NO :6所示,Me094的ORF 序列下游引物Me094-F(_)的碱基序列如序列表中SEQ ID N0:7所示。
[0051] (2)转化农杆菌
[0052] 取_70°C保存的LBA4404根癌农杆菌感受态,置冰上融解。取1 μ L含有Me094基 因的表达载体pCAMBIA1300-BI-Me094的质粒加入到100 μ L感受态中,混匀,加入到处理好 的电击杯中。设置2200V电压,点击转化。电击完成加入900 μ 1的液体YEP培养基,28°C, 200rpm摇床培养I. 5h,菌液涂布在含50μ g/mL卡那霉素(Kan)和100μ g/mL利福平(Rif) 平板上,28 °C培养至形成单菌落。
[0053] (3)阳性克隆的鉴定与保存
[0054] 挑取转化的农杆菌单菌落接种于含50 μ g/mL Kan和100 μ g/mL Rif的液体培养 基中,28°C,200rpm摇床培养16h,取IyL菌液进行PCR检测,检测引物为Me094-F(+)和 Me094-F(_)。取检测结果为阳性的菌液,混合30%甘油,置于甘油管中,于-70°C超低温冰 箱中保存,备用。
[0055] 实施例4 :农杆菌介导的水稻遗传转化
[0056] 本发明是利用感白叶枯病栽培稻02428(栽培稻02428为市售水稻品种)的成熟 胚进行的遗传转化,具体操作过程如下:
[0057] (1)水稻愈伤的诱导和继代
[0058] 取栽培稻02428成熟种子去壳后用75%乙醇消毒l-2min,无菌蒸馏水洗涤2-3次 后,用20%的NaClO并加入一滴吐温20灭菌25min,消毒完之后用无菌蒸馏水漂洗5-6次, 漂洗干净后用无菌蒸馏水浸泡种子2-3h。最后从无菌蒸馏水中取出种子置于无菌滤纸上吸 干水分,然后接种于诱导培养基上,每皿12-15粒。28°C恒温培养箱暗培养两周后,将长出 来的愈伤组织切下接种到继代培养基上,继代一周以后用于农杆菌的转化。所述的诱导培 养基的配方是:MS+蔗糖30g/L+2, 4-二氯苯氧乙酸(2, 4-D)3. Omg/L+激动素(KT)O. 4mg/L, pH = 5· 8 ;所述的继代培养基的配方是:MS+蔗糖30g/L+2, 4-二氯苯氧乙酸(2, 4-D)2. Omg/ L+KTO. 4mg/L, pH = 5. 8〇
[0059] (2)含目的Me094基因的表达载体pCAMBIA1300-BI-Me094的农杆菌悬浮菌液的制 备
[0060] 取出保存于_70°C的含有目的Me094基因的表达载体pCAMBIA1300-BI-Me094的根 癌农杆菌LBA4404,划线接种于添加了 25μ g/mL Rif和50μ g/mL Kna的LB平板上,在28°C 下倒置暗培养2-3d ;从平板上挑取单菌落,接种于30mL添加了 25 μ g/mL Rif和50 μ g/mL Kna YEB液体培养基中,28°C,180rpm震荡培养16-20h进行活化;活化后得到含目的Me094 基因的表达载体pCAMBIA1300-BI-Me094的农杆菌悬浮菌液(以下简称:悬浮菌液),用于 浸泡栽培稻02428愈伤组织。
[0061] (3)水稻愈伤组织与农杆菌的共培养
[0062] 将继代的质量较好的栽培稻02428愈伤组织切割成直径2-5mm的小块并转入共培 养基,然后将悬浮菌液注射入共培养基,使菌液充分浸泡愈伤,然后将多余菌液吸出,密封。 或者将愈伤组织浸入准备好的悬浮菌液中,浸染20min,期间要缓慢摇动,然后将菌液倒出, 用滤纸把愈伤组织吸干,置于准备好的共培养基上。28°C恒温培养箱暗培养2-3天。所述 的共培养基的配方是=MS+蔗糖30g/L+2,4-D 2. Omg/L+乙酰丁香酮(As)20mg/L,pH = 5. 2。
[0063] (4)抗性水稻愈伤组织的筛选
[0064] 首先将共培养的愈伤组织用无菌蒸馏水清洗5-6次,每次2-3min,再用MS液体 培养基+500mg/L头孢拉定震荡清洗并过夜,待洗液清澈时,用无菌水清洗2-3次后将愈伤 组织置于无菌纸上,并在超净台将其风干。接着将愈伤组织转入筛选培养基,28°C暗培养 15-20d后一些褐化的愈伤组织边缘长出乳白色的新的抗性愈伤组织,将这些新长出的抗性 愈伤组织转到新鲜配制的筛选培养基上继续筛选15-20d。所述的筛选培养基的配方是: MS+ 蔗糖 20g/L+ 甘露糖 10g/L+2, 4-D2. Omg/L+ 头孢拉定 250mg/L,pH = 5. 8。
[0065] (5)抗性水稻愈伤组织的分化、生根及炼苗
[0066] 从经两轮筛选后长出的抗性愈伤组织中,挑选乳黄色致密的抗性愈伤组织转至含 有250mg/L头孢拉定的分化培养基上,放到28°C,16h/d的光照培养箱中培养,经过15-20d 有绿点出现,30-40d进一步分化出小苗。
[0067] 待幼苗在分化培养基长至2_3cm后,将其转入生根培养基,并使幼苗的根部深 入到生根培养基的内部,放到28°C,16h/d的光照培养箱中培养,待幼苗根系比较发达苗 高约IOcm时进行炼苗。所述的分化培养基的配方是:MS+蔗糖30g/L+6-苄氨基腺嘌呤 (6_BA)2. Omg/L+萘乙酸(NAA)O. 5mg/L+KT I. 5mg/L+头孢拉定 150mg/L,pH = 5. 8。所述的 生根培养基的配方是:MS+蔗糖15g/L+NAA0. 5mg/L+头孢拉定150mg/L,pH = 5. 8。
[0068] 用自来水将幼苗根部琼脂清洗干净后放入(30mmX 180mm)大试管中,加入少量 1/2MS培养液(pH5. 8-6. 4),放在光照培养架上,每2-3天换一次1/2MS培养液。在室内炼 苗7-8d后移栽至温室土壤环境条件下,每2d浇一次水,水面以不淹没小苗为度,如果天晴, 需要遮荫到小苗成活(以吐水为准)即得到转基因再生植株。
[0069] 实施例5 :转基因再生植株的分子生物学检测和抗性鉴定
[0070] (I)PCR 检测
[0071] 待实施例4所获得的转基因再生植株生长旺盛时,取其嫩叶,提取叶片中的DNA, DNA的提取采用CTAB法。
[0072] 1)分别取100_200mg所述的转基因再生植株的幼嫩叶片加液氮研磨成粉末状,力口 入 Iml 提取缓冲液(2% CTAB,IOOmM Tris-Hcl ρΗ8· 0, 20mM EDTA ρΗ8· 0,1. 4M NaCl),置于 65°C水浴锅中保温60-90min,其间不断摇匀;
[0073] 2)室温,12000rpm 离心 IOmin ;
[0074] 3)将上清液转移至另一干净的1.5ml离心管中,加入等体积的氯仿:异戊醇 (24:1),振荡混匀;
[0075] 4)静置片刻后,室温,12000rpm离心IOmin ;
[0076] 5)将上清液转移至新的I. 5ml离心管中,加入2/3体积的异丙醇置于_20°C沉淀 30min_lh ;
[0077] 6)室温,12000rpm 离心 5min ;
[0078] 7)弃去上清液,加入ImL 75%的乙醇洗漆沉淀,室温,5000rpm离心5min ;
[0079] 8)重复步骤7 ;
[0080] 9)沉淀在室温中晾至透明状,加入50 μ LTE(K)OmM Tris-cl ρΗ8· 0, ImM EDTA)或 ddH20溶解沉淀,加入2 μ LRNA酶;
[0081] 10)取3 μ LDNA进行琼脂糖凝胶电泳,检测DNA的质量。
[0082] 以提取的水稻总DNA为模板(非转基因植株为阴性对照,ΜΕ094基因的表达载体 pCAMBIA1300-BI-Me094 为阳性对照),以Me094-F(+)和Me094-F(_)为引物,进行PCR检测。 检测结果如图2所示,其中标记为5、6、9、11、12、14的泳道处存在与阳性对照相同大小的基 因,表明这几株再生植株可能为阳性转基因植株。
[0083] (2)抗病性鉴定
[0084] 白叶枯病菌株Y8 (市售)在NA培养基斜面上28°C培养2-3天活化,配制成0D_ 处值为〇. 6的菌液;在孕穗期使用剪叶法对PCR鉴定的阳性转基因植株接种白叶枯病菌Y8 生理小种,以同期栽培的非转基因植株02428为对照(接种6株,编号为1-6),每株剪5片 完全伸展的叶子的叶尖l-3cm。接种20天后,当病斑长度明显且稳定时调查病情,对每株叶 片进行测量,其中图2中的5、6、9泳道的转基因植株在表1中标记为转基因植株1、2、3,图 2中的11、12、14泳道转基因植株在表1中标记为转基因植株4、5、6号,计算病斑长度并统 计平均值,根据方中达提出的抗性分级标准进行如下分级:
[0085] 0 级(I):病斑长度 0-0· 2cm ;
[0086] 1 级(HR):病斑长度 0· 2-1. 5cm ;
[0087] 3 级(MR):病斑长度 I. 5-3. Ocm ;
[0088] 5 级(MS):病斑长度 3. 0-5. Ocm ;
[0089] 7 级(S):病斑长度 5. 0-10. Ocm ;
[0090] 9级(HS):病斑长度大于KX 0cm。
[0091] 基因 Me094转化植株对白叶枯病菌的抗病性鉴定结果见表1,表明本发明疣粒野 生稻抗白叶枯病基因 Me094转化植株对白叶枯病菌的抗性较非转基因植株有显著提升,表 明本发明基因 Me094为抗白叶枯病的新基因。
[0092] 表1基因 Me094转化植株抗白叶枯病的抗病性鉴定结果
[0093]

【权利要求】
1. 疣粒野生稻抗白叶枯病基因财,其cDNA全长核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。
2. 权利要求1所述的疣粒野生稻抗白叶枯病基因在水稻抗白叶枯病中的应用。
【文档编号】C12N15/29GK104404053SQ201410673790
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年11月21日 优先权日:2014年11月19日
【发明者】程在全, 贺斌, 李定琴, 李维蛟, 余腾琼, 钟巧芳, 肖素勤, 柯学, 陈玲, 付坚, 王玲仙, 殷富有, 张敦宇, 蒋聪, 李娥贤, 罗红梅, 蒋春苗, 王波, 曾民, 黄兴奇 申请人:云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所
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