专利名称：体细胞杂交创造水稻新种质的方法
技术领域：
本发明涉及新品种选育的技术领域，特别是关于体细胞融合选育水稻新品种的方法。
背景技术：
野生稻具有极强的抗病虫害特性，是栽培稻的重要品种资源。疣粒野生稻是我国现存的三种野生稻之一，它对白叶枯病均表现高抗(HR)到免疫，是现今对白叶枯病抗性最强的抗原，但疣粒野生稻与栽培稻的染色体组型不同，使用常规的有性杂交难以打破生殖隔离，是利用其优异性状的障碍，随着生物工程中细胞融合技术的发展，为利用野生稻的有用基因提供了新途径。CN1326672A公开了一种抗水稻白叶枯病育种材料的选育方法，它将栽培稻和疣粒野生稻的原生质体通过不对称细胞融合得到再生植株，并与栽培稻进行回交，获得抗白叶枯病水稻育种材料。此种方法初步打破栽培稻与野生稻间的生殖隔离，迈出了水稻基因重组制作新品种的第一步，但要得到稳固的核质杂种，尚存在许多技术上的问题，例如要得到高质量的适合细胞融合的原生质体，就牵涉到如何进行愈伤组织诱导和非胚性愈伤组织向胚性组织转化，以及建立大容量胚性悬浮细胞系，适应大批量制作原生质融合体，培育出较多的再生植株。由于疣粒野生稻种子资源珍贵，禾本科作物原生质体培养再生频率低，仅为0.05～0.1％，疣粒野生稻诱导出愈伤组织愈出率仅为20％，且需一个月左右时间，远低于栽培稻，疣粒野生稻初次诱导的愈伤组织有胚性、非胚性和中间体三种状态，因此提高愈伤组织胚性细胞的含量和悬浮细胞质的质量是有待解决的关键，再是原生质体融合法，现有电场融合法和聚合物融合法，电场融合法的融合电压高，细胞损伤大，对染色体、DNA结构影响大，不利于遗传基因传递，融合参数多不易控制，容易产生多细胞融合，再生植株成活率低；聚合物融合法不会损伤细胞，能保持细胞膜完整，融合率高，易操作，再生植株成活率高，选择方便。因此在具体进行原生质体融合时应选择对细胞损伤小，对染色体和细胞膜性能影响小的聚合物融合法，以尽量保持双亲遗传基因的传递。
发明内容
本发明的首要目的是通过选择双亲具有优异特性的体细胞进行原生质体融合创造高产抗病的水稻新种质，为达到这一目的，还需对愈伤组织诱导特别是非胚性愈伤组织向胚性方向转化的措施与方法，与其相关的目的还有针对不同基因型的愈伤组织对培养基适应性不同，培养出适应原生质体融合理想的悬浮细胞系的措施和方法。
本发明采用以下的技术方案实现上述目标体细胞杂交创造水稻新种质的方法，其特征在于包含以下连续的工艺步骤A.将栽培稻和疣粒野生稻的成熟胚作外植体，接种于含生长素2，4-D的固体MS培养基中诱导愈伤组织，隔3-4周继代一次，并调整培养基的成分，用以改造非胚性愈伤组织向胚性方向转变，长出含量高的小颗粒状胚性愈伤组织；B.将上述的胚性愈伤组织接种于含生长素2，4-D的AA液体培养基中，在黑暗条件下、在80-100rpm转速下振荡培养，隔3-4天继代一次，一个月后转入扩大2-3倍体积的AA培养基中悬浮培养，胚性下降时悬浮细胞置于固体MS培养基上继代培养，再接回AA液体培养基中，以干湿交替方式培养的悬浮细胞系呈淡黄色，其胚性细胞含量高、细胞质浓、质膜光滑，分散度好。
C.将胚性悬浮细胞系培养经继代后3天的悬浮细胞置于混合酶液中游离原生质体，在27℃黑暗振荡30～50rpm条件下酶解2-3小时，观察到悬浮细胞大多数为3-5个细胞的细胞团时，静置酶解液1-2小时，使大部分原生质体游离出来，并将游离出的原生质体离心浓缩纯化；D.将上述经纯化的原生质体分别进行失活处理后，所述双亲原生质体按1∶1比例混和，然后用融合F液悬浮，再加入等量的高分子聚合物混和均匀使双亲原生质体融合30分钟左右后，用F液对融合体进行清洗稀释，在25～30分钟内稀释10～12倍时离心收集融合体；E.将上述融合体用KPR培养基包埋培养，当培养细胞进入第一次分裂时，加入适量KR培养液，促进细胞分裂，当出现4-5次分裂的小细胞团时加入少量含2，4-D2mg/L的生长素诱导细胞团向胚性发展，长至肉眼可见的细胞团时，将其转入N6培养基，待分化出小植株后，转入NAA壮苗培养基培养。
经过上述过程后，栽培稻与疣粒野生稻种子成熟胚外植体细胞融合体长出再生植株，对融合体再生植株进行形态观察，植株形态明显偏向栽培稻，也具有野生稻的特性，对第3代杂种进行RAPD、PCR分子检测，结果表明其子代电泳条带与亲本疣粒野生稻和栽培稻的条带相符，在12份材料中通过随机引物扩增后，DNA分子检测证明有10份材料是疣粒野生稻与栽培稻的融合杂种。
上述体细胞融合体进行6代选育，到第6代种植130份株系，其中有79份材料无分离，占61.2％，尚有50份材料分离较大，含38.7％。在选育过程中，对一些株型好，穗型大，剑叶挺，抗性好的材料及时利用。先后用于常规晚粳稻及杂交晚粳的选育，至2001年秋为止，作亲本20份，用这些亲本，育成第1代219份，第2代132份，第3代以上的有95份。2000年曾测产2份，2001年测产2份，其中1份亩产达601.4公斤，比对照提高3.7％。
图1为体细胞杂交各个工序状态结果照片，其中1为栽培稻大粒香原生质体，2为疣粒野生稻原生质体，3为第二次分裂的融合体，4为培养一个月的融合体小细胞团，5为在预分化培养基上50天形成的致密细胞，6为60天后融合体植株苗，7为第一代体细胞融合体植株，8为融合体再生植株分子检测的RAPD图谱。
图2为第6代体细胞杂交植株测产田。
实施例描述本发明的实验材料为疣粒野生稻(o.meyeriana.)栽培稻(oryza Sntnval.)栽培稻选用中国水稻研究所提供的大粒香。大粒香为高产、优质的粳稻优良品种，但抗病性差，对白叶枯病敏感。疣粒野生稻是我国现存的三种野生稻之一，种子资源少而珍贵。
大粒香栽培稻与疣粒野生稻体细胞杂交的实施过程按以下步骤进行。
1.胚性愈伤组织的诱导和继代以栽培稻大粒香和疣粒野生稻的成熟胚作外植体，将去壳的种子用70％的酒精消毒30秒钟，然后转入0.1％的升汞中处理10-20分钟，再用无菌水冲洗2-3次，晾干备用。沿无菌米盾片方向切下成熟胚，将胚接种于含2，4-D生长素2mg/L固体培养基MS中诱导愈伤组织，每隔3-4周继代一次。大粒香约6-10天陆续诱导出愈伤组织，疣粒野生稻40天后才诱导出愈伤组织，愈出率仅20％远低于栽培稻，因而为充分利用稀少野生稻资源，重点关注培育疣粒野生稻。疣粒野生稻胚性组织的转化条件按下述方法创立，在继代MS培养基中添加Pro500mg/L+Gln500mg/L+CH300mg/L用改造疣粒野生稻的果冻状非胚性组织，在改造培养基中继代2-3次，愈伤组织质地开始变硬向着胚性方向转变，并长成小颗粒状的胚性组织。
2.胚性悬浮细胞系的建立与培养从疣粒野生稻和栽培稻大粒香的胚性愈伤组织中，选择颜色淡黄、结构松散的小颗粒状态愈伤组织，接种于含2，4-D生长素2mg/L的AA液体培养基中，每个100ml的三角瓶内装10-15ml的AA液体培养基，在黑暗条件下振荡培养，摇床的转速为80-100rpm，开始时每隔3-4天继代一次，每次吸出1/3的上清液后，加入等量的新鲜培养液，并在倒置显微镜下观察悬浮细胞的生长情况。1个月后，将悬浮细胞转入250ml含AA培养液30～40升的三角瓶中悬浮细胞培养，每周继代一次，并根据愈伤组织的生长状态改变培养基的部分成分，促进悬浮细胞加快松散和胚性的保持。为充分利用疣粒野生稻有限资源疣粒野生稻悬浮细胞培养4-5个月后，悬浮细胞质开始变稀、胚性下降，将悬浮细胞质重新在固体MS培养上继代一段时间，再接种于AA液体培养基中，进行干湿交替培养以促进胚性悬浮细胞质的成长，若将培养液中维生素B1含量提高到10mg/L，继代2-3次后悬浮细胞开始变黄，培养液变澄清，呈现生长旺盛状态。每周细胞生长量增加一倍时，细胞质浓、质膜光滑、分散度好的细胞群体，胚性悬浮细胞系基本建成。
3.原生质体的游离及纯化在胚性悬浮细胞系的不同时期，选取继代天数不等的悬浮细胞，通常以继代后3天的悬浮细胞为游离最佳时期，此时悬浮细胞处于对数生长期，细胞代谢旺盛，游离出的原生质体活性强。将悬浮细胞置于混合酶液中游离原生质体，确定最佳的酶解时期。酶液组成为2％的纤维素酶，1.0％果胶酶，5mmol/LMES，CPW盐和13％的甘露醇，PH＝5.6。游离原生质体时先在27℃，黑暗，30～50rpm的条件下酶解2-3小时，观察到悬浮细胞为3-5个细胞的细胞团时，静置1-2小时，收集滤液，转速500rpm离心收集原生质体。离心沉淀物用CPW盐+13％甘露醇清洗2-3次，最后用KPR培养液清洗2次。纯化后的原生质体用FDA处理在荧光显微镜下检测原生质体的活力。
4.原生质体的细胞融合选取纯化后的疣粒野生稻和栽培稻大粒香原生质体分别做失活处理，以2.5mmol/L的碘乙酰胺(IOA)处理大粒香原生质体15分钟，纯化其细胞质，然后用CPW盐+13％甘露醇清洗2次，洗净残留的IOA；采用软X-射线照射疣粒野生稻原生质体60分钟，固定电压220V，电流3mA处理后包埋培养7天供融合时采用。把处理过的双亲原生质体按1∶1比例(野生稻略多于栽培稻)混合，然后用融合F液悬浮，再加入等量的聚乙二醇(PEG)分子量为8000的聚合物混合均匀，促进原生质体融合。融合30分钟后用F液对融合体系进行清洗稀释，开始稀释尽可能慢，稀释4倍体积后可加快稀释速度，25～30分钟稀释至10-12倍时，离心收集融合体，分别以CPW盐+13％甘露醇和KPR清洗。融合F液配方组成NaCl 140mmol/L，KCl 5mmol/L，Na2HPO40.75mmol/L，CaCl22H2O125mmol/L，PH＝7.0。
5.原生质体的植板培养悬浮在KPR培养液中的细胞融合体经45℃的水浴热击5分钟后，迅速放进0℃的冰水中冷却10秒钟，用含1.2％低熔点琼脂糖的KPR培养基包埋培养。包埋时以原生质体最终密度0.5～1×106个/ml，植板于小培养皿，待琼脂糖固定后分制成4-6块，并加入0.3ml左右的液体培养基，最后用P膜封口后暗培养。培养7天后计算原生质体植板率。当培养细胞进入第一次分裂时，加入适量KP培养基降低培养基的渗透压，促进培养细胞的分裂。当出现4-5次分裂的小细胞团时，加入含少量2，4-D生长素的AA培养液以诱导细胞团向胚性发展，长至肉眼可见的细胞团时，将细胞转入N6培养基，在21～26℃温差交替变化的条件下诱导分化。待分化出小植株后，转入NAA壮苗培养基培养，促进幼苗根的发生。幼苗长到4-5cm时，在室温下练苗2-3天，然后移栽到温室中培养。
6.融合体再生植株的分子检测对第3代疣粒野生稻和大粒香的体细胞杂交后代植株进行RAPD、PCR分子检测，结果表明其子代电泳条带与亲本疣粒野生稻和栽培稻的条带相同，证明有10份材料是疣粒野生稻与大粒香的融合杂种。
7.融合体细胞杂交后代植株进行抗病性检测验证，第3代获得7份抗性较好材料，平均在5级以上，到第6代在132份材料中表现高抗的有4份，中抗的有27份。
8.体细胞杂交材料进行了6代的选育在选育过程中，对一些株型好，穗型大，剑叶挺，抗性好的材料及时利用。先后用于常规粳稻及杂交晚粳的选育，至2001年秋为止，做亲本的20份，用这些亲本，育成第1代219份，第2代132份，第3代以上的有95份。2000年曾测产2份，2001年测产2份。其中1份亩产达601.4公斤，比对照提高3.7％。
表1.疣粒野生和大粒香的体细胞杂交6代群体的主要表现
由表1所列的数据和图2照片反映的植株形状表明经过6代的优势利用表明疣粒野生稻与大粒香栽培稻的体细胞杂交优势基本稳定，在培育优质、高产、抗病的水稻新品种工作中成果显著。
权利要求
1.体细胞杂交创造水稻新种质的方法，其特征在于包含以下连续的工艺步骤A.将栽培稻和疣粒野生稻的成熟胚做外植体，接种于含生长素2，4-D的固体MS培养基中诱导愈伤组织，隔3-4周继代一次，并调整培养基的成分，用于改造非胚性愈伤组织向胚性方向转变，长出含量高的小颗粒状胚性愈伤组织；B.将上述的胚性愈伤组织接种于含生长素2，4-D的AA液体培养基中，在黑暗条件下，在80-100rpm转速下振荡培养，隔3-4天继代一次，一个月后转入扩大2-3倍体积的AA培养基中悬浮培养，胚性下降时悬浮细胞置于固体MS培养基上继代培养，再接回AA液体培养基中，以干湿交替方式培养的悬浮细胞系呈淡黄色，其胚性细胞含量高、细胞质浓、质膜光滑、分散度好；C.将胚性悬浮细胞系培养经继代后3天的悬浮细胞置于混合酶液中游离原生质体，在27℃黑暗振荡30～50rpm条件下酶解2-3小时，观察到悬浮细胞大多数为3-5个细胞的细胞团时，静置酶解液1-2小时，使大部分原生质体游离出来，并将游离出的原生质体离心浓缩纯化；D.将上述经纯化的原生质体分别进行失活处理后，所述双亲原生质按1∶1比例混和，然后用融合F液悬浮，再加入等量的高分子聚合物混和均匀使双亲原生质体融合30分钟左右后，用F液对融合体进行清洗稀释，在25～30分钟内稀释10～12倍时离心收集融合体；E.将上述融合体用KPR培养基包埋培养，当培养细胞进入第一次分裂时，加入适量KR培养液，促进细胞分裂，当出现4-5次分裂的小细胞团时加入少量含2，4-D2mg/L的生长素诱导细胞团向胚性发展，长至肉眼可见的细胞团时，将其转入N6培养基，待分化出小植株后，转入NAA壮苗培养基培养。
2.根据权利要求1所述的体细胞杂交创造水稻新种质的方法，其特征是高分子聚合物为分子量大于4000的聚乙二醇(PEG)；融合F液的组成配方为NaCl140mmol/L，KCl 5mmol/L，Na2HPO40.75mmol/L，CaCl22H2O 125mmol/L，PH＝7.0。
3.根据权利要求1所述的体细胞杂交创造水稻新种质的方法，其特征是胚性愈伤组织在继代MS培养基中添加Pro500mg/L+Gln500mg/L+CH300mg/L用于改造疣粒野生稻的非胚性组织向胚性方向转变。
4.根据权利要求1所述的体细胞杂交创造水稻新种质的方法，其特征是胚性悬浮细胞培养液中维生素B含量提高到10mg/L，继代2-3次后悬浮细胞开始变黄，培养液变澄清，呈现生长旺盛状态。
5.根据权利要求1所述的体细胞杂交创造水稻新种质的方法，其特征是悬浮在KPR培养液中的细胞融合体经45℃水浴热击5分钟，迅速放进0℃的冰水中冷却10秒钟，用含1.2％低熔点琼脂糖KPR培养基包埋培养。
6.根据权利要求1所述的体细胞杂交创造水稻新种质的方法，其特征是原生质体植板培养包埋时以原生质体最终密度0.5～1×106个/ml植板于小培养皿。
全文摘要
体细胞杂交制造水稻新种质的方法，它通过疣粒野生稻与栽培种大粒香的胚体细胞愈伤组织和悬浮细胞体系，采用高分子聚合物PEG和F液进行原生质体融合，获得体细胞种间杂种株，通过白叶枯病的人工剪叶接种和DNA分子鉴定，进行了6代选育，获得高产、优质和抗病的水稻新种质。
文档编号A01H4/00GK1498529SQ02145209
公开日2004年5月26日 申请日期2002年11月11日 优先权日2002年11月11日
发明者严成其, 颜秋生, 张雪琴, 皇甫伟国, 黄坚, 倪建刚, 沈岚, 应成波, 裘尧军, 陈国 , 陆永法, 马荣荣, 肖浩永, 钱凯先, 吴平, 国 申请人:严成其