用于普通野生稻遗传完整性分析的引物组合及其应用
【技术领域】
[0001 ]本发明设及遗传完整性分析引物，具体地说，设及用于普通野生稻遗传完整性分 析的SSR分子标记核屯、引物。
【背景技术】
[0002] 普通野生稻是栽培稻的近缘祖先种，蕴藏着大量优良基因资源，其亲和性好，杂交 结实率高，是栽培稻育种的珍贵基因资源。普通野生稻是我国野生稻中分布最广的一个种， 然而，近几十年来，由于环境破坏等原因，其分布面积极大退化。普通野生稻种质资源保护 的主要方式包括：原生境保护、种质圃保护和种质库保存种子。其保护保存的目标十分明 确:保持其遗传完整性和多样性。
[0003] 种质遗传完整性是指种质原始遗传组成状态。种质资源保护和保存需要保证在保 存和繁殖更新过程中群体的遗传结构得到完全的保持，包括基因型频率及等位基因频率等 与原始群体保持一致。因此准确评价种质的遗传完整性具有重要的理论和实践意义。
[0004] 因此，亟需获得可用于普通野生稻遗传完整性分析的SSR核屯、引物，并建立普通野 生稻遗传完整性分析方法。
【发明内容】
[0005] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种用于普通野生稻遗传 完整性分析的引物组合及其应用。
[0006] 为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
[0007] 本发明提供一套用于普通野生稻遗传完整性分析的SSR核屯、引物组合与方法，所 述方法是基于SSR分子标记原理，采用经过前期大量筛选工作所获得的25对多态性核屯、引 物，对90~160个单株的普通野生稻基因组DNA进行扩增，利用生物分析软件统计分析群体 的遗传多样性指数，反映群体的遗传完整性保持情况。
[000引第一方面，本发明提供用于普通野生稻遗传完整性分析的引物组合，其由如下25 个引物对组成：
[0009] SSR01:正向引物如沈Q ID NO. 1所示;反向引物如沈Q ID NO.2所示； [0010]55302:正向引物如沈9 10^.3所示;反向引物沈9 10^.4所示；
[0011] SSR03:正向引物如沈Q ID NO.5所示;反向引物如沈Q ID NO.6所示；
[0012] SSR04:正向引物如沈Q ID NO.7所示;反向引物如沈Q ID NO.8所示；
[0013] SSR05:正向引物如沈Q ID NO.9所示;反向引物如沈Q ID NO. 10所示；
[0014] SSR06:正向引物如沈Q ID NO. 11所示;反向引物如沈Q ID NO. 12所示；
[0015] SSR07:正向引物如沈Q ID NO.13所示;反向引物如沈Q ID NO.14所示；
[0016] SSR08:正向引物如沈Q ID NO. 15所示;反向引物如沈Q ID NO. 16所示；
[0017] SSR09:正向引物如沈Q ID NO. 17所示;反向引物如沈Q ID NO. 18所示；
[001引 SSR10:正向引物如沈Q ID NO. 19所示;反向引物如沈Q ID NO.20所示；
[0019] SSRll:正向引物如沈Q ID NO.21所示;反向引物如沈Q ID NO.22所示；
[0020] SSR12:正向引物如沈Q ID NO.23所示;反向引物如沈Q ID NO.24所示；
[0021] SSR13:正向引物如沈Q ID NO.25所示;反向引物如沈Q ID NO.26所示；
[0022] SSR14:正向引物如沈Q ID NO.27所示;反向引物如沈Q ID NO.28所示；
[0023] SSR15:正向引物如沈Q ID NO.29所示;反向引物如沈Q ID NO.30所示；
[0024] SSR16:正向引物如沈Q ID NO.31所示;反向引物如沈Q ID NO.32所示。
[0025] SSR17:正向引物如沈Q ID NO.33所示;反向引物如沈Q ID NO.34所示。
[0026] SSR18:正向引物如沈Q ID NO.35所示;反向引物如沈Q ID NO.36所示。
[0027] SSR19:正向引物如沈Q ID NO.37所示;反向引物如沈Q ID NO.38所示。
[002引 SSR20:正向引物如沈Q ID NO.39所示;反向引物如沈Q ID NO.40所示。
[0029] SSR21:正向引物如沈Q ID NO.41所示;反向引物如沈Q ID NO.42所示。
[0030] SSR22:正向引物如沈Q ID NO.43所示;反向引物如沈Q ID NO.44所示。
[0031] SSR23:正向引物如沈Q ID NO.45所示;反向引物如沈Q ID NO.46所示。
[0032] SSR24:正向引物如沈Q ID NO.47所示;反向引物如沈Q ID NO.48所示。
[0033] SSR25:正向引物如沈Q ID NO.49所示;反向引物如沈Q ID NO.50所示。
[0034] 上述25对核屯、引物是从550对SSR引物中，经筛选获得。引物筛选方法为，W160个 单株的江西东乡普通野生稻DNA为模板，分别用550对SSR引物进行扩增，扩增产物经聚丙締 酷胺凝胶电泳、凝胶银染、统计扩增结果。针对每对引物在160个单株中的扩增结果，剔除不 具备多态性的引物，保留具有多态性的引物，最终筛选获得25对多态性核屯、引物。筛选得到 的引物相对未被选择引物，在体现种质的遗传多样性方面具有明显优势。
[0035] 第二方面，在上述引物组合存在的前提下，任何含有该引物组合的产品均在本发 明的保护范围内，例如含有上述引物组合的试剂或试剂盒。原因在于，其在应用时利用的是 本发明所述引物组合的特殊性，且得到的结果取决于本发明所述引物组合的特殊性。
[0036] 第Ξ方面，本发明提供前述引物组合在分析普通野生稻遗传完整性方面的应用。 由于前述引物组合能够针对普通野生稻的遗传多样性进行鉴定，所得结果可用于判断种质 遗传完整性的保持情况。因此，本发明提供前述引物组合可用于普通野生稻遗传完整性分 析。
[0037] 第四方面，本发明提供一种分析普通野生稻遗传完整性的方法，W待分析样本的 基因组DNA为模板，利用前述引物组合进行PCR扩增，经聚丙締酷胺凝胶电泳分离扩增产物， 利用生物学软件对电泳结果进行遗传结构分析。
[0038] 进一步地，所述待分析样本的样本量(群体量)为90~160。原因在于，经实验统计 发现，群体量越小，特异性单株平均频率越低，其标准偏差和变异系数很大，表明采用过小 的群体量，取样误差十分明显。群体量增加至90单株时，特异单株频率逐步稳定趋近10%， 变异系数控制在15% W内，基本可W代表160单株的多样性。因此在进行普通野生稻遗传完 整性分析时，需要保证90株W上的群体量。
[0039] 作为优选，所述基因组DNA提取自普通野生稻植株叶片，因幼嫩叶片中次生代谢物 质含量低，易于获得高质量DNA，优选幼嫩叶片。
[0040] 优选地，所述种子来自江西东乡普通野生稻。
[0041] 作为优选，为了更好的观察扩增结果，可采用6%聚丙締酷氨凝胶电泳分离扩增产 物，电泳结束后采用银染法染色。
[0042] 更进一步地，所述PCR扩增的反应体系为：10 X PCR缓冲液(含Mgh) 2.0化，2.5mmol/ L dNTP 1.5yL，5UAiL Taq 0.化L，化mol/L SSR引物2.0yL，20ng/yL DM 2.0化，d加 2〇 12.0化。
[0043] 所述PCR扩增的程序为：94°C预变性5min; 95°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸 lmin，38个循环;72°C延伸lOmin。待溫度降至10°C后，于4°C冰箱内保存备用。
[0044] 基于上述优选方案，本发明提供一个完整具体的实施方式，包括如下步骤：
[0045] (1)采用CTAB法提取普通野生稻待分析样本叶片的基因组DNA，样本为90~160单 株稻；
[0046] (2) W步骤(1)提取的DNA为模板，用前述引物组合进行PCR扩增；
[0047] (3)采用6%聚丙締酷氨凝胶电泳对扩增产物进行分离，电泳结束后采用银染法染 色；
[0048] (4)利用生物学软件分析电泳结果。
[0049] 其中，所述步骤(4)具体为：统计扩增谱带类型，参照DNA marker(pBR322)估计片 段大小。使用P0PGE肥等软件对不同普通野生稻种质群体进行遗传结构分析，比较不同种质 等位基因数、有效等位基因数、基因多样性指数、香农指数等指标。采用SPSS或SAS等软件， 分析群体间各指数差异，若无显著差异则认为群体遗传完整性得到有效保持，若差异达到 显著水平，则认为群体遗传完整性发生了改变。
[0050] 本发明的有益效果在于：
[0051] 本发明W江西东乡普通野生稻为材料，通过大量实验研究，筛选出了一批可用于 普通野生稻遗传完整性分析的SSR核屯、引物，建立了用于普通野生稻遗传完整性分析的引 物组合，并基于此，建立了分析方法。
[0052] 本发明提供的分析方法适用于普通野生稻种质遗传完整性的分析。所筛选的引物 组合和最少90个单株的群体量，为准确分析普通野生稻种质保存和繁殖更新过程中遗传完 整性检测提供了标准方法。
【附图说明】
[0053] 图1为本发明实施例1中引物SSR16对部分单株普通野生稻的扩增结果。左起第5泳 道为Marker，其它泳道为野生稻单株DNA扩增结果。
[0054] 图2为本发明实施例1中不同大小群体量多态性单株差异。
【具体实施方式】
[0055] 下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是W下实 施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技 术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可W对本发明进行各种修改和替换。
[0056] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0057] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[005引实施例1普通野生稻种质的遗传完整性分析
[0化9] 1.实验材料
[0060] w江西东乡普通野生稻为试材，取一定量种子育苗后移栽至大田进行常规管理。 随机选取160个单株，取其幼嫩叶片，-20°c冻存备用。
[0061 ] 2.基因组DNA提取:采用CTAB法分别提取160个单株叶片的基因组DNA。
[0062] 3.引物合成及筛选
[0063] (1)合成引物：参考水稻SSR引物序列，随机选择550对引物，经生工生物工程（上 海)股份有限公司合成引物。
[0064] (2)引物筛选:采用160个单株DNA模板，利用全部550对引物进行扩增，扩增产物经 聚丙締酷胺凝胶电泳、凝胶银染，根据扩增结果，剔除不具多态性的引物，共筛选出25对特 异多态性引物，其中引物SSR16的扩增结果见图1，引物的序列信息见表1:
[0065] 表1普通野生稻SSR特异多态性引物序列
[0066]
[0067] (3)适宜样本量：W引物SSR16的扩增结果为例，160单株中有128单株的扩增结果 完全一样(主带型），另外32单株DNA扩增结果与主带型不同，将运些单株称为特异单株，如 图1中左起第1、2、7和9等泳道。160单株群体量中，特异单株频率为20%。将160株群体随机 分成10株、20株......150株不同大小群体，统计每个群体量特异性单株频率，统计20次计 算平均值、标准偏差和变异系数。结果发现随着群体量增加特异性单株频率逐渐增加（图 2)。群体量越小，特异性单株平均频率越低，其标准偏差和变异系数很大，表明采用过小的 群体量，取样误差十分明显。群体量增加至90单株时，特异单株频率逐步稳定趋近20%，变 异系数控制在15% W内，基本可W代表160单株的多样性。因此认为进行普通野生稻遗传完 整性分析时，需要保证90株W上的群体量。
[0068] 实施例2不同生活力群体普通野生稻种质的遗传完整性分析
[0069] 1.实验材料
[0070] W江西东乡普通野生稻为试材。采集普通野生稻种子，采用高溫高湿方法老化种 子获得不同发芽率的群体(具体见表2)，每个群体取一定量种子育苗后移栽至大田进行常 规管理。每个群体随机选取160个单株，取其幼嫩叶片，-20°C冻存备用。
[0071] 2.基因组DNA提取:采用CTAB法分别提取160个单株叶片的基因组DNA。
[0072] 3.不同生活力群体遗传完整性比