同时定量南美白对虾中两种致病菌活菌的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及水产品中食源性致病菌的检测方法，具体设及一种同时定量南美白对 邮中两种致病菌活菌的方法。
【背景技术】
[0002] 副溶血性弧菌和沙口氏菌是水产品中两种重要的食源性致病菌，给公众健康造成 了极大的安全隐患。在中国，副溶血性弧菌是水产品中头号食源性致病菌，因为消费生的或 未煮熟的水产品极易感染副溶血性弧菌，从而造成严重的急性肠胃炎，并伴随有恶屯、、头 疼、低烧等症状。沙口氏菌是引起海产品食物中毒事件发生的第二大食源性致病菌，每年约 有20.8 %的海产品食物中毒事件是由该菌引起的。
[0003] 南美白对邮是南亚和东南亚部分地区最为重要的水产品，同时，因为其味道鲜美、 营养丰富，也是运些区域的最受欢迎的食品之一。但是，副溶血性弧菌和沙口氏菌在对邮中 的检出率逐年上升，已经成为生鲜对邮食用安全的重要影响因素。因此，构建一种快速、精 准和高效的方法用于南美白对邮中运两种食源性致病菌的定量检测，对于水产品工业的健 康发展和公众卫生状况的改善具有极为重要的意义。
[0004] 使用传统方法定量检测食品中的运两种食源性致病，包括增菌富集、选择性培养 基的分离W及生理生化鉴定等多个复杂的步骤，需要5~7天的时间。相比于传统方法，巧光 定量PCR是一种更加快速、高效、省力的方法，已被广泛应用于食品中多种食源性致病菌的 快速定量检测。为了获得更高的效率，不少研究构建了多重巧光定量PCR的方法，该方法可 同时定量检测食品中两种及两种W上的食源性致病菌。然而，无论是巧光定量PCR还是多重 巧光定量PCR技术都存在一个极大的缺陷，基于DNA的检测方法无法区分样品中的死、活菌， 常导致假阳性现象，从而过高估计了样品中致病菌的数量。
[0005] 叠氮漠化丙锭(Propidium monoazide，PMA)是一种对核酸具有高度亲和力的光敏 反应染料，能够进入细菌的死细胞中，选择性地交联死菌的DNA，将其与DNA扩增检测技术相 结合，可有效地抑制死菌细胞DNA的扩增。近年来，利用PMA结合巧光定量PCR技术，已经广泛 应用于多种食源性致病菌的活菌检测，例如副溶血性弧菌、单增李斯特菌、空肠弯曲菌、沙 口氏菌、大肠杆菌等重要的食源性致病菌，被认为是目前最为有效的新型活菌检测技术。然 而，研究表明该新型活菌检测方法仍存在一定的技术难点，其区分死活菌的能力常受到多 种因素的影响，例如菌株、PMA浓度、暗处理时间、PCR扩增体系W及样品基质等。因此，目前 将PMA与多重实时巧光PCR相结合的研究仍鲜少被报道，成为高通量活菌定量检测的热点和 难点问题。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供了一种同时定量南美白对 邮中两种致病菌活菌的方法。本发明旨在于构建一种新型快速的活菌定量技术，结合PMA和 多重巧光定量PCR的优点，同时定量检测生鲜南美白对邮中活的副溶血性弧菌和沙口氏菌。 运一方法创新地将多重巧光定量PCR技术和PM染料相结合，达到了快速定量南美白对邮中 两种重要致病菌活菌的目的，W期提供一种有效的技术支持用于改善水产品安全和保护公 众的健康。
[0007]本发明的目的是通过W下技术方案来实现的：
[000引本发明设及一种同时定量南美白对邮中两种致病菌活菌的方法，所述方法包括如 下步骤：
[0009] S1、将叠氮漠化丙锭母液加入待测的南美白对邮邮液匀浆中，获得叠氮漠化丙锭- 样品混合液;暗处理后曝光，高速离屯、，收集菌体；
[0010] S2、对所述菌体进行DNA提取；
[00川 S3、w提取得到的DNA为模板，W副溶血性弧菌的t化基因和沙口氏菌的orgC基因 作为祀基因，进行多重巧光定量PCR扩增反应，输出相应的循环阔值；
[0012] S4、将所述循环阔值分别与副溶血性弧菌标准曲线、沙口氏菌标准曲线进行对照， 获得副溶血性弧菌和沙口氏菌的活菌浓度。
[001引优选的，步骤S1中，所述叠氮漠化丙锭母液的制备包括:每Img叠氮漠化丙锭溶解 于98化L dd出0中获得2mM的母液，并于-20°C下避光保存。
[0014] 优选的，步骤S1中，所述南美白对邮邮液匀浆是在每225ml蛋白腺水中加入25g生 鲜南美白对邮，均质处理2~5min而得。
[0015] 优选的，步骤S1中，所述叠氮漠化丙锭-样品混合液中叠氮漠化丙锭的浓度为10化 M，暗处理的时间为15~20min，曝光的时间为15~20min。
[0016] 优选的，步骤S2中，所述提取是按照天根细菌基因组DM提取试剂盒的说明书进行 的。
[0017] 优选的，步骤S3中，所述多重巧光定量PCR扩增反应采用的副溶血性弧菌正引物 扣4斗的序列如56〇10^.1所示，副溶血性弧菌反引物1化-如勺序列如56〇10^.2所示， 沙口氏菌正引物orgC-F的序列如SEQ ID NO. 3所示，沙口氏菌反引物orgC-R的序列如SEQ ID NO.4所示。
[0018] 优选的，步骤S3中，所述多重巧光定量PCR扩增反应中，副溶血性弧菌探针标记FAM 作为报告基团，其序列如SEQ ID NO.5所示;沙口氏菌探针标记皿X作为报告基团，其序列如 沈Q ID NO.6所示。
[0019] 优选的，所述多重巧光定量PCR扩增反应体系为20化，包括化L 10 XPCR Buffer、 1.2化浓度为50mM的MgS〇4溶液、0.5化浓度为lOmM的dNTPs mix溶液、0.2化浓度为抓/化的 Taq DNA聚合酶、0.5化浓度为ΙΟμΜ的副溶血性弧菌正引物和反引物、0.5化浓度为1 ΟμΜ的沙 口氏菌正引物和反引物、0.2化浓度为ΙΟμΜ的副溶血性弧菌探针、0.2化浓度为ΙΟμΜ的沙口 氏菌探针、DNA模板化LW及d地2〇 12.化L。
[0020] 优选的，所述多重巧光定量PCR扩增反应的条件为：95°C预变性2min，95°C变性 15s，60°C退火Imin，进行40个循环。
[0021] 优选的，步骤S4中，所述副溶血性弧菌标准曲线是W已知副溶血性弧菌活菌浓度 的南美白对邮邮液匀浆为对象，利用其菌落计数的结果和多重巧光定量PCR输出的Ct值构 建的标准曲线;所述沙口氏菌标准曲线是W已知沙口氏菌活菌浓度的南美白对邮邮液匀浆 为对象，利用其菌落计数的结果和多重巧光定量PCR输出的Ct值构建的标准曲线。
[0022] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0023] 1)本发明创新地将多重巧光定量PCR技术和PMA染料相结合，达到了快速定量南美 白对邮中两种重要致病菌活菌的目的；
[0024] 2)本发明明确了最优的PMA处理条件和有效的多重巧光定量PCR体系。
[0025] 3)本发明成功地解决了快速、准确定量南美白对邮中两种重要致病菌活菌的水产 品安全问题。
[0026] 4)本发明建立的PMA结合多重巧光定量PCR技术具有特异性强和灵敏度高的优点。
【附图说明】
[0027] 图1为PMA多重巧光定量PCR方法在人工接种邮样中构建的标准曲线;其中，A为副 溶血性弧菌的标准曲线，B为沙口氏菌的标准曲线，菌落通过选择性培养基(TCBS琼脂，BS琼 月旨)进行计数；
[0028] 图2为PMA多重巧光定量PCR法在人工接种生邮样品中的应用；其中，A为平板计数 对比于PMA多重巧光定量PCR定量检测副溶血性弧菌，B为平板计数对比于多重巧光定量PCR 定量检测副溶血性弧菌，C为平板计数对比于PMA多重巧光定量PCR定量检测沙口氏菌，D为 平板计数对比于多重巧光定量PCR定量检测沙口氏菌。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合实施例对本发明进行详细说明。W下实施例将有助于本领域的技术人员 进一步理解本发明，但不W任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可W做出若干调整和改进。运些都属于本发明的保 护范围。
[0030] 实施例
[0031] 本实施例设及一种同时定量南美白对邮中两种致病菌活菌的方法;具体包括如下 步骤：
[0032] 1.材料与方法
[0033] 1.1受试菌株和培养条件
[0034] 受试菌共18株被用于验