基于适体修饰多孔氧化铝膜的李斯特菌高灵敏检测新方法
【专利摘要】本发明涉及一种利用靶分子与其适体之间的特异性识别的性质，构建的基于纳米通道限域特性的单核增生李斯特菌快速超灵敏检测器。本发明还涉及将经单核增生李斯特菌的DNA适体修饰的多孔氧化铝膜作为电极，组装自制电解池；铁氰化钾离子作为探针离子，对单核增生李斯特菌进行检测的方法。当LM存在且浓度较低时，电流升高值随其浓度的增加显著下降；随LM浓度的增加，电流变化值下降；LM浓度在100?1250CFU/mL范围内时，与电流升高值之间呈线性关系；当其浓度大于1500CFU/mL时，电流变化值趋于稳定。因此，该检测方法对LM的最低检测限可达100CFU/mL，线性范围100?1250CFU/mL，可在10分钟内完成检测。经108CFU/mL的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌对照实验，表明其对李斯特菌具有高度选择性。
【专利说明】
基于适体修饰多孔氧化铝膜的李斯特菌高灵敏检测新方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种利用靶分子与其适体之间的特异性识别的性质，构建的基于纳米 通道限域特性的单核增生李斯特菌超灵敏检测器。本发明还涉及将经单核增生李斯特菌的 DNA适体修饰的多孔氧化铝膜作为电极，组装自制电解池;铁氰化钾离子作为探针离子，对 单核增生李斯特菌进行快速、灵敏检测的方法。
【背景技术】
[0002] 单核细胞增生李斯特菌(学名：Listeria monocytogenes)，是一种兼性厌氧细菌， 为李斯特菌症的病原体;是革兰氏阳性菌，属厚壁菌门。单核细胞增生李斯特菌（以下均简 称LM)是一种人畜共患病的病原菌。它与大肠杆菌0157:H7、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌一起 被世界卫生组织列为四大食源性致病菌。李斯特菌病就是由单核细胞增生李斯特氏菌引起 的一种罕见却严重的疾病。这种病原菌能在正常的烹饪温度下被杀死，也能在冷藏温度低 至〇°C的条件下缓慢生长。大多数健康的人可能会发生没有表现出临床症状但被感染李斯 特菌的情况，但是一些易感人群，例如孕妇、老年人和免疫力低下的人(如艾滋病患者、糖尿 病患者等），会面临十分严重的健康危险。食品中的LM的存在可能是源于其成分(特别是原 材料)或者来自于周围的环境，包括设备，成品和原材料之间的交叉污染。如果在温度等环 境条件，尤其是酸度和水分含量的允许下，LM可以通过长期贮存的过程大量繁殖生长。LM的 生长对于环境的要求不高，不管有氧还是缺氧的环境都可以；其生长的温度范围比较广范， 但是它的最适生长温度为37°C，在4°C时生长就比较缓慢，-18°C时可以存活;耐高盐且耐酸 性强:20%的氯化钠、pH值的范围为4.4~9.6的条件下都可以生长;在氧分压略低、二氧化 碳压力略高的条件下生长良好。这些性质导致了 LM在自然环境中几乎无处不在。因为LM是 最致命的食源性病原菌之一，可以造成20~30%的临床感染者死亡，所以，对LM的检测有很 大的必要性。
[0003] 目前，LM的检测方法有很多，可以分为以下几种:①传统的分离与鉴定的方法;② 显色培养基的快速鉴定技术;③全自动微生物分析系统④分子生物学的方法;⑤免疫学方 法等。食品中的李斯特菌的传统检测方法有3个主要环节:增菌、分离、鉴定，整个过程中有 一系列的生化反应和其它实验。这个方法不仅耗时还特别繁琐。显色培养基的快速鉴定技 术则是针对LM的葡萄糖苷酶和毒力因子。全自动微生物分析系统是微生物检测的发展方向 之一，它的过程则比较简单、便捷，且准确率比较高。然而在LM的检测过程中，如果被检测样 品中的目标细菌的数量比较少，这使得检测有一定的难度。通过人们的努力，基于核酸基础 的分子生物学检测方法出现了。这个方法通过扩增少量目标细菌的特定基因信号而完成检 测，可以达到李斯特菌属或种的水平上的检测。聚合酶链式反应(PCR)在食品检测中的应用 使得它不仅可以利用DNA分子，还可以用RNA分子。这些探针试剂盒的检测速度快且检测结 果准确。免疫学的检测方法是基于抗体对于抗原之间的自然亲和力，但这个检测方法所需 要的样品是必须经过纯化才能准确的检测出LM。然而它和PCR检测相比，聚合酶链式反应的 检测结果更加容易受样品的影响。这种检测方法是很快速和准确的，且操作过程比较简单。 不过，它的不足就是灵敏度低、特异性差。因此，希望研究出一种对于LM的检测更加准确、更 加灵敏和更加便捷的方法。
[0004] 新兴的纳米材料因其特殊性质被关注而加以运用。张广腾等人利用金纳米颗粒的 玻碳电极固定巯基修饰的DNA探针于其表面，制备了检测LM的电化学生物传感器。这个方法 的最低检出限达到了 1.0乂1(^12111〇1/1(0嫩浓度计）。钟子清等人利用经表面修饰的纳米免 疫磁珠对检样中的LM进行富集，在磁场作用下被吸附分离以消除干扰因素;从而提高了检 测灵敏度，达到高检出率并缩短了检测时间。本发明使用经LM适体修饰的多孔氧化铝膜纳 米材料作电极，对LM进行电化学检测。
[0005] 金属铝化学性质活泼，易被氧化而在铝表面形成一层致密的氧化铝膜层。氧化铝 膜层较稳定，能防止内部的铝继续被氧化，对铝起到保护作用。经研究，氧化铝膜层是纳米 多孔结构，能够保持固定的形状和结构特征。将铝加入一些酸性介质中作为阳极进行电化 学反应，生成多孔氧化错膜，又称多孔阳极氧化错膜(porous aluminium oxide film，简称 PAA膜hPAA膜具有六角的微孔，形成特别的、自组织的高度有序的纳米阵列结构;这些微孔 垂直于铝基体。微孔的直径随着阳极氧化条件的变化发生改变。根据不一样的氧化条件，微 孔的直径可以在10~500nm之间变化。随着人们对PAA膜的微观结构和性能的了解和认识， PAA膜逐渐被大量用作传感器材料、分离膜材料、抗菌膜材料、催化材料、光学及光电元件、 磁性记录材料等等。本发明使用PAA膜作电化学检测中的传感器基体元件。
[0006] 适配体传感器是生物传感器的一种。生物传感器涵盖了生物、化学和信号处理等 技术，具有高度的特异性、准确度和精密度。它分为很多种类:适配体传感器、微生物传感 器、免疫传感器和酶传感器等等。在食品的安全检测方面，适配体传感器的应用越来越被人 们关注了。本发明使用适配体传感器进行实验。适体是一段单链DNA或者RNA寡聚核苷酸链， 能够特异性结合具有高亲和力的靶细胞。与抗体相比，适体具有极大的潜力。高亲和力的抗 体的生产是昂贵且费时的。因此，对于任何一个目标分子的抗体的制备都是不容易的。但亲 和力高，特异性高，稳定性高，简单的标记，PCR定向扩增核酸和低成本生产等都是适体相对 于抗体的优势方面。在对目标分子的进行识别的过程中，核酸适体有比较明确的三维结构。 自从1990年第一个适体被发现后，不同类型的适体已经在体外进行了评估，有蛋白质、毒 素、ATP，甚至病毒和细胞表面标志。因此，由于其高度的选择性和灵敏度，基于几乎所有类 型的适体的生物传感器和纳米生物传感器已被广泛研究。本发明中所使用的适体是DNA适 体。它是一段DNA单核苷酸链，有47个氨基，其中"5' "端修饰了一个醛基（5' -CHO-ATC CAT GGG GCG GAG ATG AGG GGG AGG AGG GCG GGT ACC CGG TTG AT-3')以便于将其固定在多 孔氧化铝膜的纳米通道内表面。此适体可以通过体外人工合成、方法简单;可以进行靶向识 另IJ;与LM有高度的亲和力;有极高的选择性。这也是适配体传感器一个重要的优势。因此，本 发明方法能准确，简单，高度适宜地检测LM。
【发明内容】
[0007] 本发明涉及基于纳米通道限域特性的单核增生李斯特菌超灵敏检测器，制备该检 测器的方法，以及该检测器对单个单核增生李斯特菌进行检测的用途。
[0008] 一方面，本发明提供了经单核增生李斯特菌的DNA适体修饰的多孔氧化铝膜电极， 其中所述多孔氧化铝膜电极为表面经单核增生李斯特菌的DNA适体修饰的多孔氧化铝膜， 并且在其另一面镀金。具体地，所述多孔氧化铝膜的孔径为20nm。更具体地，所述DNA适体是 DNA单核苷酸链，有47个氨基，其中"5〃'端修饰了一个醛基(5Y-CH0-ATC CAT GGG GCG GAG ATG AGG GGG AGG AGG GCG GGT ACC CGG TTG AT-3')。另外，更具体地，所述镀金是通过使 用真空离子溅射仪实现的。
[0009] 另一方面，本发明提供了制备上述多孔氧化铝膜电极的方法，所述方法包括：（1) 将多孔氧化铝膜逐步清洗、煮沸、浸泡以修饰官能团；（2)用真空离子溅射仪在多孔氧化铝 膜一面镀金、过塑制成膜电极；（3)将与单核增生李斯特菌特异性结合的适体修饰在多孔氧 化铝膜的通道内表面上。具体地，所述多孔氧化铝膜的孔径为20nm。更具体地，在步骤（1) 中，使用30%的过氧化氢来修饰羟基;使用3-氨丙基三乙氧基硅烷来修饰氨基。在步骤(3) 中，所使用的适体是DNA单核苷酸链，有47个氨基，其中"5'"端修饰了一个醛基(5' -CH0-ATC CAT GGG GCG GAG ATG AGG GGG AGG AGG GCG GGT ACC CGG TTG AT-37)〇
[0010] 另一方面，本发明提供了基于纳米通道限域特性的单核增生李斯特菌超灵敏检测 器，其包括上述多孔氧化铝膜电极和电解池，其中所述电解池含有磷酸二氢钠与磷酸氢二 钠配制的pH值为7的PBS缓冲溶液，以及作为探针离子的铁氰化钾离子。具体地，所述PBS缓 冲溶液的浓度为ImM;铁氰化钾离子的浓度为更优选为ImM。
[0011] 另一方面，本发明提供了上述多孔氧化铝膜电极在定性检测样品中的单核增生李 斯特菌的用途。具体地，该样品中还可任选含有金黄色葡萄球菌(低于108CFU/mL)和大肠杆 菌(低于 108CFU/mL)。
[0012] 另一方面，本发明还提供了上述检测器在定量检测样品中的单核增生李斯特菌的 用途。具体地，该样品中还可任选含有金黄色葡萄球菌(低于108CFU/mL)和大肠杆菌(低于 108CFU/mL)〇
[0013] 本发明通过研究基于纳米通道限域特性的李斯特菌检测技术，利用经LM适体修饰 的多孔氧化铝膜作电极组装自制电解池对单核增生李斯特菌进行定量检测。从实验得出， 基于纳米限域空间的电化学检测方法用来检测样液中的单核增生李斯特菌是可行的。
[0014] 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和LM的浓度为108CFU/mL。如附图所示，检测高浓度的 金黄色葡萄球菌和大肠杆菌而产生的电流变化值与LM的电流变化值有显著差异，能够明确 地分辨出来。如上，本发明用的LM适体有很高的选择性，当样品中存在大量的金黄色葡萄球 菌、大肠杆菌的情况下，仍对LM的检测也没影响。
【附图说明】
[0015] 图1是适体修饰的多孔氧化铝膜检测LM的原理示意图。
[0016] 图2是LM适体修饰在多孔氧化铝膜表面的示意图。
[0017] 图3是多孔氧化铝膜(PAA)的扫描电子显微镜SEM图。
[0018] 图4是适体修饰的多孔氧化铝膜检测LM的实验结果。（a)不同浓度LM的电流响应曲 线；（b)电流升高值随LM浓度变化曲线图，由图4(a)中的电流响应曲线整理得出。
[0019] 图5是金黄色葡萄球菌(SA)、大肠杆菌(E.coli)和LM的对照电流实验图。（a)不同 类型菌的电流响应曲线；（b)不同类型菌电流升高值的变化图，由图5(a)中的电流响应曲线 整理得出。
[0020] 图6是金黄色葡萄球菌(SA)、大肠杆菌(E.coli)和LM的对照SEM图。（a)对照实验； (b)103CFU/mL LM;(c)108CFU/mL E.coli;(d)108CFU/mL SA。
【具体实施方式】
[0021] 下面，将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行详细的 描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发 明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实 施例，都属于本发明保护的范围。
[0022] 需要说明的是，在本文中，术语"包括"、"包含"或者其任何其他变体意在涵盖非排 他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而 且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有 的要素。
[0023] 1材料与方法
[0024] 1.1材料与仪器
[0025]表 1
[0027]表 2
[0030] 金片、电炉、PET膜、2mm的手握式打孔器、高压灭菌锅、（Varioskan Flash)全自动 酶标仪等。实验用水均为超纯水（> 18.2M Ω，Mi 11 ipore France)。1^适体在"5' "端修饰有 一个醛基官能团。电解池中所用缓冲溶液为磷酸二氢钠与磷酸氢二钠配制的PBS缓冲溶液， pH值为7.0 〇 [0031] 1.2实验方法
[0032]本发明中运用了适体与单核增生李斯特菌的特异性结合与电化学检测。首先，用 PAA膜制备金电极。将孔径为20nm的多孔氧化铝膜逐步清洗、煮沸、浸泡以修饰官能团。然 后，用真空离子溅射仪在多孔氧化铝膜一面镀金、过塑制成膜电极;再修饰LM适体于纳米孔 径内表面。将制备好的单核增生李斯特菌的菌悬液加入自制电解池内与安装好的膜电极反 应，进行检测。
[0033]图1所示为适体修饰的多孔氧化铝膜检测LM的原理。在自制电解池中，进样池中的 铁氰化钾离子能够通过纳米通道从而到达检测池这面的金膜上，使得高价铁被还原，产生 电流。李斯特菌的存在时，李斯特菌与适体特异性结合而附在PAA膜表面上，阻碍了铁氰化 钾离子通过纳米通道，这就使得产生的电流的大小发生变化。因为纳米通道的孔径为20nm， 而单核增生李斯特菌的大小为0.4~0.5μπιΧ 0.5~2. Ομπι; LM则附在PAA膜表面，造成LM本身 堵塞纳米孔道使铁氰化钾离子通过纳米通道的数量会下降。其次，在LM周围形成的负电场 (LM表面存在磷酸和羧酸等基团，导致LM带-14.2mV的表面电荷)与铁氰化钾离子相互作用 使得其附近的纳米通道传输铁氰化钾离子的量也减少。由此，我们就可以通过利用基于纳 米材料的电化学适配体传感器来对单核增生李斯特菌进行定量检测。
[0034] 1.2.1多孔氧化铝膜电极的制备
[0035] 图2所示的LM适体修饰的多孔氧化铝膜电极的制备，其具体步骤如下：
[0036] (1)清洗:取一片PAA膜于10mL小烧杯内。在通风橱中用丙酮清洗PAA膜3-4次，用时 约5min，结束后用超纯水清洗。
[0037] (2)修饰羟基:在烧杯中加入10mL的30 %的过氧化氢溶液，在电炉上煮沸。保持微 沸状态30min，倒掉烧杯内剩余的过氧化氢溶液，用超纯水清洗PAA膜。
[0038] (3)修饰氨基:在(2)中的烧杯里分别加入0.5mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES) 和9.5mL的丙酮。保鲜膜封口，放进干燥器中静置24h。
[0039] (4)干燥：在通风橱内用丙酮浸洗PAA膜4-5次，约5min，除去残余的未结合的 APTES。然后用超纯水清洗，将清洗干净的PAA膜用氮气吹干。
[0040] (5)镀金：吹干的PAA膜用真空离子溅射仪在其一面上镀金。镀金条件：电流为 10mA，时间200s。需要注意的是，区分镀金面和未镀金面。
[00411 (6)封塑：用打孔器在PET膜上打一个直径2mm的圆孔。将PAA膜夹在PET膜中间，使 圆孔位于PAA膜中间位置。细长的金导线放在PAA膜的镀金面边上，与膜重叠。用过塑机封 塑，剪去多余部分。PAA膜电极制成待用。
[0042] 1.2.2 LM适体溶液的配制与修饰
[0043] LM适体使用前需要离心，离心条件:转速5000r/min，时间5min。然后在10D的LM适 体中加入200yL的0.1M PBS (pH = 7.0)溶液，配制成1 ΟμΜ的溶液。将电解池组装好(镀金面朝 着检测池，未镀金面是进样池）。在进样池和检测池里分别加入2.5mL的PBS缓冲溶液，静置 半小时。吸去缓冲溶液，将电解池竖立起来，进样池在上面。接着，在进样池和PAA膜接触的 面上滴几滴DNA适体溶液(注意排掉接触面的空气）。将其放在密闭空间里24小时，旁边放半 杯水以防LM适体溶液挥发。修饰好LM适体的PAA膜保存于4°C的PBS溶液中。
[0044] 1.2.3 LM、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌悬液的制备
[0045] 李斯特菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的培养。用胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤(TSB-YE)进行LM培养，培养液配制为:3.6g(TSB-YE)/100mL;而大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均用 营养肉汤培养基进行培养，培养液配制为：1.9g/100mL。接种后在生化培养箱里培养24h。将 培养好的菌液各取lmL分别进行稀释(0.85的灭菌生理盐水），稀释至实验用细菌浓度，待 用。然后用酶标仪测菌液的0D600值，同时用相应的菌液进行平板计数法数菌落数，得出 0D600值与细菌浓度的关系图，以便下次使用。
[0046] 1.2.4检测方法
[0047] (1)空白实验：修饰有LM适体的PAA膜在自制电解池中通过电化学工作站进行检 测。电解池两边所加电势为0V。
[0048] (2)对照实验:将制好的大肠杆菌菌悬液加入进样池里，检测池空着。静置半小时， 注意排除菌液与PAA膜接触面的气体。用超纯水清洗电解池，进行检测。金黄色葡萄球菌的 检测与大肠杆菌步骤相同。
[0049] (3)李斯特菌的检测:将制备好的李斯特菌菌悬液加入进样池，从低浓度到高浓度 依次进行检测。每个浓度的菌悬液都要同（2)中一样加入进样池静置半小时，清洗干净，再 检测。各个菌悬液的浓度用平板菌落计数法进行测定。
[0050] 2结果与讨论
[0051] 2.1多孔氧化铝膜的结构
[0052]图3是PAA膜的扫描电子显微镜(SEM)图片，为高度有序的多孔结构，孔径尺寸约为 20nm〇
[0053] 2.2单核增生李斯特菌的检测
[0054]在优化的条件下，配制ImM浓度的roS溶液和铁氰化钾溶液。李斯特菌菌悬液按浓 度梯度由低到高依次进行检测。将其加入进样池中，室温下静置l〇min。清洗干净，进行检 测，结果如图4所示。
[0055] 由图4(a)得出结论：电流随时间先快速升高，到达峰值，再下降至趋于稳定。电流 变化值随LM浓度的增大而变小。铁氰化钾通过PAA膜的纳米通道到达金膜上，铁氰化钾离子 被金还原产生电流;而铁氰化钾离子通过纳米通道到达金膜的速度先增加到峰值然后慢慢 下降至稳定。LM浓度变大，PAA膜上附着的LM越多，纳米通道传输的铁氰化钾离子越少。图4 (b)是电流升高值随LM浓度变化曲线图，由图4(a)中的电流响应图整理得出。当LM存在且浓 度较低时，电流升高值随其浓度的增加显著下降；随LM浓度的增加，电流变化值下降；LM浓 度在100-1250CFU/mL范围内时，与电流升高值之间呈线性关系；当其浓度大于1500CFU/mL 时，电流变化值趋于稳定。因此，该检测方法对LM的最低检测限可达100CFU/mL，线性范围 100-1250CFU/mL，可在10分钟内完成检测。
[0056] 2.3对照实验
[0057]在优化的实验条件下，配制相应浓度的PBS溶液和铁氰化钾溶液。依次在进样池中 加入制好的大肠杆菌菌悬液和金黄色葡萄球菌菌悬液。室温下静置半小时。清洗干净，然后 进行检测。检测结果如图所示：图5是金黄色葡萄球菌(SA)、大肠杆菌(E.coli)和LM的对照 实验图。金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和LM的浓度为108CFU/mL。由图得，检测高浓度的金黄色 葡萄球菌和大肠杆菌而产生的电流变化值与LM的电流变化值有显著差异，能够明确地分辨 出来。这说明本实验用的LM适体有很高的选择性，当样品中存在大量的金黄色葡萄球菌、大 肠杆菌，仍对LM的检测也没影响。
[0058]图6是LM适体修饰的PAA膜在不同菌液中浸泡后的SEM图。图6(a)为空白对照，图6 (b)、图6(c)和图6(d)是经LM适体修饰的PAA膜分别在103CFU/mL李斯特菌、108CFU/mL大肠 杆菌和108CFU/mL金黄色葡萄球菌溶液中浸泡后的SEM图。图6(a)、图6(b)、图6(c)、图6(d) 与图5相对应，从而验证了图5所得结论。
[0059] 3结论
[0060]本发明通过研究基于纳米通道限域特性的单个李斯特菌检测技术，利用经LM适体 修饰的多孔氧化铝膜作电极组装自制电解池对单核增生李斯特菌进行定性检测。从实验得 出，基于纳米限域空间的电化学检测方法用来检测样液中的单个单核增生李斯特菌是可行 的。这种方法对LM的检测不仅有高度的亲和力和选择性，还有很高的灵敏度。当LM存在且浓 度较低时，电流升高值随其浓度的增加显著下降；随LM浓度的增加，电流变化值下降；LM浓 度在100-1250CFU/mL范围内时，与电流升高值之间呈线性关系；当其浓度大于1500CFU/mL 时，电流变化值趋于稳定。因此，该检测方法对LM的最低检测限可达100CFU/mL，线性范围 100-1250CFU/mL，可在10分钟内完成检测。这说明本实验采用的方法对LM的检测的显著优 点是高灵敏度和选择性，其次是操作简捷，省时，成本低廉。
【主权项】
1. 经单核增生李斯特菌的DNA适体修饰的多孔氧化铝膜电极，其中所述多孔氧化铝膜 电极为表面经单核增生李斯特菌的DNA适体修饰的多孔氧化铝膜，并且在其电极的外侧面 镀金。2. 根据权利要求1的多孔氧化铝膜电极，其中所述多孔氧化铝膜的孔径为20nm。3. 根据权利要求1或2的多孔氧化铝膜电极，其中所述DNA适体是DNA单核苷酸链，有47 个氨基，其中 "5"'端修饰了一个醛基（S'-CHO-ATC CAT GGG GCG GAG ATG AGG GGG AGG AGG GCG GGT ACC CGG TTG AT-3,）。4. 根据权利要求1-3中任一项的多孔氧化铝膜电极，所述镀金是通过使用真空离子溅 射仪实现的。5. 制备权利要求1的多孔氧化铝膜电极的方法，所述方法包括： 步骤(1):将多孔氧化铝膜逐步清洗、煮沸、浸泡以修饰官能团； 步骤(2):用真空离子溅射仪在多孔氧化铝膜一面镀金、过塑制成膜电极； 步骤(3):将与单核增生李斯特菌特异性结合的适体修饰在多孔氧化铝膜的纳米通道 表面上。6. 根据权利要求5的方法，所述多孔氧化铝膜的孔径为20nm。7. 根据权利要求5或6的方法，其中，在步骤（1)中，使用30%的过氧化氢来修饰羟基;使 用3-氨丙基三乙氧基硅烷来修饰氨基。8. 根据权利要求5-7中任一项的方法，在步骤(3)中，所使用的适体是DNA单核苷酸链， 有47个氨基，其中 "5"'端修饰了一个醛基（5'CHO-ATC CAT GGG GCG GAG ATG AGG GGG AGG AGG GCG GGT ACC CGG TTG AT-3,）。9. 基于纳米通道限域特性的单核增生李斯特菌超灵敏检测器，其包括权利要求1-4中 任一项的多孔氧化铝膜电极和电解池，其中所述电解池含有磷酸二氢钠与磷酸氢二钠配制 的pH值为7的PBS缓冲溶液，以及作为探针离子的铁氰化钾离子。10. 根据权利要求9的检测器，所述PBS缓冲溶液的浓度为ImM;铁氰化钾离子的浓度为 lmM〇11. 根据权利要求1-4的多孔氧化铝膜电极在定量检测样品中的单核增生李斯特菌的 用途。12. 根据权利要求11的用途，该样品中还可任选含有低于108CFU/mL的金黄色葡萄球菌 和低于10 8CFU/mL的大肠杆菌。13. 根据权利要求9或10的检测器在定量检测样品中的单核增生李斯特菌的用途。14. 根据权利要求13的用途，该样品中还可任选含有低于108CFU/mL的金黄色葡萄球菌 和低于10 8CFU/mL的大肠杆菌。
【文档编号】G01N27/26GK106018508SQ201610333218
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月19日
【发明人】李承勇, 周浓, 周春霞, 王娟
【申请人】广东海洋大学