基于李斯特菌属的佐剂的制作方法
【专利摘要】本发明提供了使用单核细胞增生李斯特菌作为增强受试者中的免疫应答的佐剂的方法和组合物。
【专利说明】基于李斯特菌属的佐剂
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2011年3月11日提交的美国临时专利申请号61/451，651的优先权。本申请另外要求2011年11月7日提交的美国专利申请号13/290,783的优先权，后者是2011年2月7日提交的美国申请号12/993,380的部分继续申请，后者要求2009年5月19日提交的国际申请号PCT/US09/44538的优先权，后者要求2008年5月19日提交的美国临时申请号61/071，792的权益。本申请还要求2011年2月15日提交的美国专利申请号13/027,828的优先权，后者要求2010年2月15日提交的美国临时申请号61/304，701的权益。本申请还要求2011年8月16日提交的美国专利申请号13/210,696的优先权，后者是2010年11月12日提交的美国申请号12/945，386的部分继续申请，后者要求2009年11月11日提交的美国临时申请号61/260，277的权益。这些申请特此通过引用整体并入本文中。
【技术领域】
[0003]本发明提供了使用单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)作为佐剂用于增强受试者中的免疫应答的方法和组合物。
【背景技术】
[0004]佐剂在免疫疗法中具有广泛应用。大多数基于细胞的免疫疗法在提供抗原特异性的治疗之前施用佐剂。通常，这些抗原包括GM-CSF、IL-1、QP-100、钥孔虫戚血蓝蛋白和其它。这些佐剂通常通过静脉内(IV)、肌肉内(IM)、真皮内(ID)或类似的途径全身性地施用。
[0005]单核细胞增生李斯特菌(Lm)是细胞内病原体，其主要感染抗原呈递细胞，且已经适应生活在这些细胞的细胞质中。单核细胞增生李斯特菌和它产生的被称作李斯特菌溶血素O(LLO)的蛋白具有强佐剂性能，其与用于基于细胞的免疫疗法的大多数佐剂不同，可以在提供抗原特异性的治疗以后施用。
[0006]为了降低受试者的患病频率和由其引起的死亡率，需要快速地升高受试者对任意抗原的免疫应答的方法。本发明提供了通过利用由分泌非溶血性LLO或截短的ActA的活Lm疫苗提供的佐剂性能来升高受试者(诸如成年人和儿童)的免疫应答的方法。
[0007]此外，提供了相同的方法，以在受试者中重建免疫应答或促进免疫应答恢复至正常或大约正常水平，所述受试者由于癌症已经经历细胞毒性治疗。
【发明内容】
[0008]在一个实施方案中，本发明涉及在受试者中重建免疫应答的方法，所述方法包括下述步骤:给所述受试者施用活的减毒的李斯特菌属疫苗株。
[0009]在一个实施方案中，本发明涉及在受试者中重建免疫应答的方法，所述方法包括下述步骤:给所述受试者施用 活的减毒的李斯特菌属疫苗株，所述李斯特菌属菌株包含核酸分子，其中所述核酸分子包含编码含PEST多肽的第一开放读码框。[0010]在一个实施方案中，本发明涉及在受试者中促进细胞毒性治疗后的免疫应答恢复的方法，所述方法包括给所述受试者施用活的减毒的李斯特菌属疫苗株。
[0011]在一个实施方案中，本发明涉及在受试者中促进细胞毒性治疗后的免疫应答恢复的方法，所述方法包括给所述受试者施用活的减毒的李斯特菌属疫苗株。在另一个实施方案中，所述李斯特菌属菌株包含核酸分子，其中所述核酸分子包含编码含PEST多肽的第一开放读码框。
[0012]在一个实施方案中，本发明涉及提高疫苗的免疫原性的方法，所述方法包括下述步骤:给受试者共同施用所述疫苗和基于李斯特菌属的佐剂，其中所述基于李斯特菌属的佐剂增强所述疫苗的免疫原性，由此提高所述疫苗的免疫原性。
[0013]在一个实施方案中，本发明涉及在受试者中以不依赖于抗原的方式增强对疾病的免疫应答的方法，所述方法包括给所述受试者施用基于李斯特菌属的佐剂。
[0014]从下述详细描述实施例和附图将明白本发明的其它特征和优点。但是，应当理解，所述详细描述和具体实施例尽管指出了本发明的优选实施方案，但是仅仅通过例证给出，因为本领域技术人员从该详细描述会明白在本发明的精神和范围内的各种变化和修改。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1是大肠杆菌-李斯特菌属穿梭质粒pGG55(上面)和pTV3(下面)的示意图。CAT(-):大肠杆菌氯霉素转移酶；CAT(+):李斯特菌属氯霉素转移酶；Ori Lm:李斯特菌属的复制起点；0ri Ec:大肠杆菌的pl5复制起点；prfA:李斯特菌属致病性调节因子A ；LL0:C-端截短的李斯特菌溶血素0，包括它的启动子；E7:HPV E7 ；p60-dal ；p60启动子和李斯特菌属dal基因的表达盒。还描绘了选择的限制位点。
[0016]图2显示了存在于李斯`特菌属菌株E⑶的基因组的inlC区域的上游和下游的DNA序列。DNA-up (红色)、inlC基因(蓝色)和DNA-down (黑色)。
[0017]图3显示了被克隆进温度敏感的质粒PKSV7中以建立ini C缺失突变体的DNA的序列。用于克隆这些区域的限制性酶位点用大写字母表示且标有下划线。GAATTC-EcoR1、GGATCC-BamHI 和 CTGCAg-PstI。将 EcoR1-PstI 插入序列克隆进载体 pKSV7 中。
[0018]图4显示了 Lm-dd和Lm_ddD actA菌株的示意图。凝胶显示了使用寡核苷酸1/2和寡核苷酸3/4的PCR产物的大小,所述寡核苷酸使用菌株Lm-dd和Lm_ddA actA的e染色体DNA作为模板得到。
[0019]图5显示了存在于李斯特菌属染色体的actA基因的上游和下游的DNA序列。以斜体字显示的区域含有存在于Lmdd Δ actA菌株中的残余actA序列元件。标有下划线的序列gtcgac代表XhoI的限制位点，其为actA的N-T和C-T区域之间的连接部。
[0020]图6描绘了由Lm疫苗株⑷的施用引起的肿瘤消退。圆圈代表原初小鼠，倒三角形代表施用Lmdd-TV3的小鼠，十字叉代表施用Lm-LL0E7的小鼠。
[0021 ] 图7显示了肿瘤中MDSC和Treg的减少。在Lm疫苗接种(LmddAPSA和LmddAE7)以后的MDSC (右侧图)和Treg (左侧图)的数目。
[0022]图8显示的抑制测定数据证实，在李斯特菌属疫苗接种后，得自TPSA23肿瘤的单核细胞MDSC更少地受到抑制。MDSC的抑制能力的这种变化不是抗原特异性的，因为用PSA-抗原特异性的T细胞以及用非特异性地刺激的T细胞观察到相同的抑制减少。No MDSC组显示了应答者T细胞当不受刺激时分裂的缺乏，且最后一组显示了在没有加入MDSC来抑制分裂时受刺激的细胞的分裂。左侧图显示了每组的单个细胞分裂周期。右侧图显示了合并的分裂周期。
[0023]图9显示的抑制基因测定数据证实，李斯特菌属对脾单核细胞MDSC没有影响，且它们仅以抗原特异性的方式产生抑制。No MDSC组显示了应答者T细胞当不受刺激时分裂的缺乏，且最后一组显示了在没有加入MDSC来抑制分裂时受刺激的细胞的分裂。左侧图显示了每组的单个细胞分裂周期。右侧图显示了合并的分裂周期。
[0024]图10显示的抑制基因测定数据证实，在李斯特菌属疫苗接种后，得自肿瘤的粒细胞MDSC具有降低的抑制T细胞的能力。MDSC的抑制能力的这种变化不是抗原特异性的，因为用PSA-抗原特异性的T细胞以及用非特异性地刺激的T细胞观察到相同的抑制减少。NoMDSC组显示了应答者T细胞当不受刺激时分裂的缺乏，且最后一组显示了在没有加入MDSC来抑制分裂时受刺激的细胞的分裂。左侧图显示了每组的单个细胞分裂周期。右侧图显示了合并的分裂周期。
[0025]图11显示的抑制基因测定数据证实，李斯特菌属对脾粒细胞MDSC没有影响，且它们仅以抗原特异性的方式产生抑制。No MDSC组显示了应答者T细胞当不受刺激时分裂的缺乏，且最后一组显示了在没有加入MDSC来抑制分裂时受刺激的细胞的分裂。左侧图显示了每组的单个细胞分裂周期。右侧图显示了合并的分裂周期。
[0026]图12显示的抑制基因测定数据证实，得自肿瘤的Treg仍然是抑制性的。在该肿瘤模型中存在Treg的抑制能力的非抗原特异性的方式的轻微下降。No Treg组显示了应答者T细胞当不受刺激时分裂的缺乏，且最后一组显示了在没有加入Treg来抑制分裂时受刺激的细胞的分裂。左侧图显示 了每组的单个细胞分裂周期。右侧图显示了合并的分裂周期。
[0027]图13显示的抑制基因测定数据证实，脾Treg仍然是抑制性的。NoTreg组显示了应答者T细胞当不受刺激时分裂的缺乏，且最后一组显示了在没有加入Treg来抑制分裂时受刺激的细胞的分裂。左侧图显示了每组的单个细胞分裂周期。右侧图显示了合并的分裂周期。
[0028]图14显示的抑制基因测定数据证实，常规CD4+T细胞对细胞分裂没有影响，不论它们存在于小鼠的肿瘤还是脾中。左侧图和右侧图显示了合并的分裂周期。
[0029]图15显示的抑制基因测定数据证实，在李斯特菌属疫苗接种后，得自4T1肿瘤的单核细胞MDSC具有降低的抑制能力。MDSC的抑制能力的这种变化不是抗原特异性的，因为用Her2/neu-抗原特异性的T细胞以及用非特异性地刺激的T细胞观察到相同的抑制减少。No MDSC组显示了应答者T细胞当不受刺激时分裂的缺乏，且最后一组显示了在没有加入MDSC来抑制分裂时受刺激的细胞的分裂。左侧图显示了每组的单个细胞分裂周期。右侧图显示了合并的分裂周期。
[0030]图16显示的抑制基因测定数据证实，对脾单核细胞MDSC不存在李斯特菌属特异性的作用。No MDSC组显示了应答者T细胞当不受刺激时分裂的缺乏，且最后一组显示了在没有加入MDSC来抑制分裂时受刺激的细胞的分裂。左侧图显示了每组的单个细胞分裂周期。右侧图显示了合并的分裂周期。
[0031]图17显示的抑制基因测定数据证实，在李斯特菌属疫苗接种后，得自4T1肿瘤的粒细胞MDSC具有降低的抑制能力。MDSC的抑制能力的这种变化不是抗原特异性的，因为用Her2/neu-抗原特异性的T细胞以及用非特异性地刺激的T细胞观察到相同的抑制减少。No MDSC组显示了应答者T细胞当不受刺激时分裂的缺乏，且最后一组显示了在没有加入MDSC来抑制分裂时受刺激的细胞的分裂。左侧图显示了每组的单个细胞分裂周期。右侧图显示了合并的分裂周期。
[0032]图18显示的抑制基因测定数据证实，对脾粒细胞MDSC不存在李斯特菌属特异性的作用。No MDSC组显示了应答者T细胞当不受刺激时分裂的缺乏，且最后一组显示了在没有加入MDSC来抑制分裂时受刺激的细胞的分裂。左侧图显示了每组的单个细胞分裂周期。右侧图显示了合并的分裂周期。
[0033]图19显示的抑制基因测定数据证实，在李斯特菌属疫苗接种后，得自4T1肿瘤的Treg的抑制能力下降。该下降不是抗原特异性的，因为用Herf/neu-特异性的和非特异性的应答者T细胞观察到所述Treg抑制能力变化。左侧图显示了每组的单个细胞分裂周期。右侧图显示了合并的分裂周期。
[0034]图20显示的抑制基因测定数据证实，对脾Treg不存在李斯特菌属特异性的作用。应答者T细胞都能够分裂，不论它们是否是抗原特异性的。左侧图显示了每组的单个细胞分裂周期。右侧图显示了合并的分裂周期。
[0035]图21表明，曼森血吸虫(S.mansoni)感染的小鼠中的IFN-Y产生减少。
[0036]图22表明，具有慢性血吸虫病的小鼠中的IL-4水平增加。
[0037]图23表明，被曼森血吸虫感染的小鼠中的IL-10产生增加。
[0038]图24表明，血吸虫感染不会改变针对免疫显性CTL和辅助表位的抗原特异性的疫
苗应答。
【具体实施方式】
[0039]新颖的且迄今未开发的用途是，建立没有外源性抗原的、活的减毒的李斯特菌属疫苗株。
[0040]新颖的且迄今未开发的用途是，建立没有抗原的、活的减毒的李斯特菌属疫苗株，这使得所述李斯特菌属能够仅分泌非溶血形式的LLO(Lm-LLO)或截短的ActA(Lm-ActA)作为佐剂。本文中提供的发明实现了第一种活佐剂。
[0041]在一个实施方案中，本文提供了在受试者中重建免疫应答的方法，所述方法包括下述步骤:给所述受试者施用活的减毒的李斯特菌属疫苗株。在另一个实施方案中，所述李斯特菌属菌株包含核酸分子，其中所述核酸分子包含`编码含PEST多肽的第一开放读码框。
[0042]在一个实施方案中，所述李斯特菌属过表达所述含PEST多肽。在另一个实施方案中，所述含PEST多肽是非溶血性LLO蛋白或其免疫原性片段、ActA蛋白或其截短片段、或PEST氨基酸序列。
[0043]在一个实施方案中，本文提供了在受试者中促进细胞毒性治疗后的免疫应答恢复的方法，所述方法包括给所述受试者施用活的减毒的李斯特菌属疫苗株。在另一个实施方案中，所述李斯特菌属菌株包含核酸分子，其中所述核酸分子包含编码含PEST多肽的第一开放读码框。
[0044]在一个实施方案中，本文提供了提高疫苗的免疫原性的方法，所述方法包括下述步骤:给受试者共同施用所述疫苗和基于李斯特菌属的佐剂，其中所述基于李斯特菌属的佐剂增强所述疫苗的免疫原性，由此提高所述疫苗的免疫原性。
[0045]在一个实施方案中，本文提供了在受试者中以不依赖于抗原的方式增强对疾病的免疫应答的方法，所述方法包括给所述受试者施用基于李斯特菌属的佐剂。
[0046]在一个实施方案中，本文提供了用于生物工程改造活Lm细菌的组合物和方法，所述活Lm细菌感染特定细胞(包括抗原呈递细胞(APC)、肝巨噬细胞、血管内皮、骨髓和其它)以及诸如实体瘤和脾等结构。在另一个实施方案中，在需要并使用佐剂来刺激免疫应答的情况下，所述活Lm佐剂随后在原位合成和分泌经修饰的LLO片段。在另一个实施方案中，所述活Lm合成ActA。在另一个实施方案中，不同于以前的佐剂，本发明实现了在原位制备佐剂的能力，且不涉及免疫佐剂的全身性施用。
[0047]在一个实施方案中，本文提供了在新生儿受试者中引起成年人水平的增强免疫应答的方法，所述方法包括下述步骤:给所述受试者施用重组李斯特菌属疫苗株。在另一个实施方案中，所述李斯特菌属菌株包含核酸分子，其中所述核酸分子包含编码非溶血性李斯特菌溶血素O(LLO)或ActA的第一开放读码框，其中所述核酸分子还包含编码代谢酶的第二开放读码框，其中所述代谢酶补充在所述重组李斯特菌属菌株的染色体中缺少的内源基因。
[0048]在一个实施方案中，本文提供了在受试者中促进细胞毒性治疗后的免疫应答恢复的方法，所述方法包括给所述受试者施用重组李斯特菌属疫苗株。在另一个实施方案中，所述李斯特菌属菌株包含核酸分子，其中所述核酸分子包含编码非溶血性李斯特菌溶血素O或ActA的第一开放读码框 ，其中所述核酸分子还包含编码代谢酶的第二开放读码框，其中所述代谢酶补充在所述重组李斯特菌属菌株的染色体中缺少的内源基因。在另一个实施方案中，所述受试者是成年人受试者。
[0049]佐剂的增加对抗原的免疫应答的能力通常表现为免疫介导的保护的显著增加。例如，体液免疫的增加通常表现为针对抗原产生的抗体的滴度的显著增加，且T-细胞活性的增加通常表现为增加的细胞增殖、增加的细胞因子产生和/或抗原特异性的细胞裂解活性。佐剂也可以改变免疫应答，例如，通过实现针对持久的Th2表型背景的Thl应答。
[0050]在一个实施方案中，本发明提供了用于预防疾病、治疗疾病和给人受试者接种疫苗的方法和组合物。
[0051]在另一个实施方案中，本发明涉及增强人、新生儿或由于癌症而已经经历细胞毒性治疗的人的免疫应答。
[0052]在一个实施方案中，基于李斯特菌属的佐剂表示活的减毒的李斯特菌属疫苗株。在另一个实施方案中，所述基于李斯特菌属的佐剂是Lm-LLO或Lm-ActA。在另一个实施方案中，Lm-LLO表达非溶血性LLO。在另一个实施方案中，Lm-ActA表达截短的ActA蛋白。在另一个实施方案中，Lm-LLO或Lm-ActA可以单独使用，或者与其中佐剂为适当的任意疗法联合使用，且可以用于通常不使用佐剂的场合，诸如化学疗法或放射疗法。
[0053]在另一个实施方案中，本文提供的李斯特菌属菌株还包含编码代谢酶的第三开放读码框。
[0054]在一个实施方案中，所述代谢酶是氨基酸代谢酶。在另一个实施方案中，所述由第二开放读码框编码的代谢酶是丙氨酸消旋酶或D-氨基酸转移酶。在另一个实施方案中，所述由第三开放读码框编码的代谢酶是丙氨酸消旋酶或D-氨基酸转移酶。在另一个实施方案中，所述代谢酶由dal基因编码，而在另一个实施方案中，所述dal基因得自枯草芽孢杆菌。在另一个实施方案中，所述代谢酶由dat基因编码。
[0055]在另一个实施方案中，所述重组李斯特菌属是减毒的营养缺陷型菌株。
[0056]在一个实施方案中，所述减毒的菌株是Lmdd。在另一个实施方案中，所述减毒的菌株是Lmdda。在另一个实施方案中，所述减毒的菌株是Lm Λ PrfA。在另一个实施方案中，所述减毒的菌株是LmAPlcB。在另一个实施方案中，所述减毒的菌株是Lm Λ PlcA。在另一个实施方案中，所述减毒的菌株是LmddA Δ inlC。在另一个实施方案中,所述LmddA Δ inlC突变株使用Lm的E⑶菌株产生，后者不同于背景菌株10403S，即Lm dal datactA(LmddA)的亲本菌株。在另一个实施方案中，该菌株发挥强佐剂作用，后者是基于李斯特菌属的疫苗的固有性质。在另一个实施方案中，该菌株从EGD李斯特菌属骨架构建得到。
[0057]在另一个实施方案中，在本发明中使用的菌株是表达非溶血性LLO的李斯特菌属菌株。在另一个实施方案中，所述李斯特菌属菌株是PrfA突变体、ActA突变体、plcB缺失突变体、或缺少PlcA和plcB的双重突变体。所有这些李斯特菌属菌株被涵盖用于本文提供的方法中。每种可能性代表本发明的一个单独实施方案。[0058]在一个实施方案中，所述LmddAA inlC突变株可安全地用于人类，并诱导高水平的先天性免疫应答。在一个实施方案中，所述inlC缺失突变体产生非抗原特异性的增强水平的先天性免疫应答。
[0059]在一个实施方案中，李斯特菌属向邻近细胞的易位通过2个单独的机制受到抑制:actA和inlC基因(它们二者都涉入该过程)的缺失，由此导致意外高水平的减毒、增加的免疫原性和作为疫苗骨架的实用性。在另一个实施方案中，李斯特菌属向邻近细胞的易位通过2个单独的机制受到抑制:actA或inlC基因(它们二者都涉入该过程)的缺失，由此导致意外高水平的减毒、增加的免疫原性和作为疫苗骨架的实用性。
[0060]内化蛋白与增加的毒力有关，且它们的存在与李斯特菌属的增加的免疫原性有关，但是，在本发明中，切除inlC基因会增加本文中提供的李斯特菌属疫苗载体的免疫原性。在另一个实施方案中，本发明提供了下述新颖性:从缺失actA的载体切离inlC基因，由此除去下述两种能力，形成肌动蛋白鞭毛(其为穿过宿主细胞膜移动和进入邻近细胞所必需)的能力，和形成跨膜通道的能力。因此，这2种缺失的组合会产生李斯特菌属疫苗载体与野生型李斯特菌属菌株或单个突变株相比降低的毒力和增加的免疫原性的惊人结果。
[0061]在另一个实施方案中，本文提供的核酸分子会整合进李斯特菌属基因组中。在另一个实施方案中，所述核酸分子是在本文也提供的重组李斯特菌属疫苗株的质粒中。在另一个实施方案中，在不存在抗生素选择的情况下，本文提供的质粒会稳定地维持在重组李斯特菌属疫苗株中。在另一个实施方案中，所述质粒不会给所述重组李斯特菌属赋予抗生素抗性。
[0062]在一个实施方案中，本文提供的重组李斯特菌属菌株是减毒菌株。在另一个实施方案中，所述重组李斯特菌属缺少ActA毒力基因。在另一个实施方案中，所述重组李斯特菌属缺少PrfA毒力基因。
[0063]在另一个实施方案中，所述重组李斯特菌属疫苗株包含佐剂，其中所述佐剂是李斯特菌溶血素O。在另一个实施方案中，所述重组李斯特菌属疫苗株包含佐剂，其中所述佐剂是ActA。
[0064]在一个实施方案中，所述李斯特菌属疫苗株是LmddAinlC142菌株。LmddAinlC142是基于这样的李斯特菌属疫苗载体:其由于inlC基因的缺失而减毒，且通过dal基因的互补而保留用于PSA体内和体外表达的质粒。在另一个实施方案中，LmddAinlC142引起强烈的且抗原特异性的抗肿瘤应答，具有破坏受试者中对异种抗原的耐受性的能力。在另一个实施方案中，所述LmddAinlC142菌株是高度减毒的，且具有比以前的李斯特菌属疫苗代更好的安全性谱，因为它更迅速地从被免疫的小鼠的脾清除。在另一个实施方案中，LmddAinlC142菌株是高度免疫原性的，能够破坏对异种抗原的耐受性，并在受试者中防止肿瘤形成。
[0065]在另一个实施方案中，本文提供的方法还提供了克服或“破坏”对作为自体抗原的异种抗原的耐受性的方法。这样的抗原可以由多种肿瘤异常地表达，使用本文提供的方法和组合物对所述肿瘤进行在本发明的范围内的治疗或预防。
[0066]在一个实施方案中，与其它治疗模式相组合的、表达李斯特菌溶血素O的重组的减毒的不含抗生素的李斯特菌属可用于增强免疫应答，以及用于预防和治疗癌症或实体瘤。在另一个实施方案中，单独的或与其它治疗剂相组合的、表达李斯特菌溶血素O的重组的减毒的不含抗生素的李斯特菌属可用于预防和治疗受试者的感染性疾病。在另一个实施方案中，所述受试者是新生儿、儿童或成年人。
[0067]在一个实施方案中，与其它治疗模式相组合的、表达ActA的重组的减毒的不含抗生素的李斯特菌属可用于增强免疫应答，以及用于预防和治疗癌症或实体瘤。在另一个实施方案中，单独的或与其它治疗剂组合的、表达ActA的重组的减毒的不含抗生素的李斯特菌属可用于预防和治疗受试者的感染性疾病。在另一个实施方案中，所述受试者是新生儿、儿童或成年人。
[0068]在一个实施方案中 ，由本文提供的方法和组合物诱导的免疫应答是治疗性免疫应答。在另一个实施方案中，它是预防性免疫应答。在另一个实施方案中，与本领域可用于在罹患本文提供的病症的受试者中诱导免疫应答的方法相比，它是增强的免疫应答。在另一个实施方案中，所述免疫应答会导致折磨受试者的本文提供的疾病的清除。
[0069]应当理解，本发明的方法可以用于治疗任何传染性疾病，在一个实施方案中，所述传染性疾病是细菌感染、病毒感染、微生物感染、微小生物感染、致病性感染或它们的组合。在另一个实施方案中，本发明的方法被用于抑制或遏制受试者的细菌感染、病毒感染、微生物感染、微小生物感染、致病性感染或它们的组合。在另一个实施方案中，本发明提供了在受试者中引起针对细菌感染、病毒感染、微生物感染、微小生物感染、致病性感染或它们的组合的细胞毒性的T-细胞应答的方法。在另一个实施方案中，本发明提供了在Thl无应答的受试者中诱导针对细菌感染、病毒感染、微生物感染、微小生物感染、致病性感染或它们的组合的Thl免疫应答的方法。在一个实施方案中，所述感染是病毒感染，在一个实施方案中，所述病毒是HIV。在一个实施方案中，所述感染是细菌感染，在一个实施方案中，所述细菌是分枝杆菌属，在一个实施方案中，所述细菌感染是结核病。在一个实施方案中，所述感染是真核生物感染，在一个实施方案中，所述真核生物是疟原虫属，在一个实施方案中，所述真核生物感染是疟疾。
[0070]在一个实施方案中，本文提供了在具有伴随性蠕虫感染的Thl无应答的受试者中诱导Thl免疫应答的方法，在另一个实施方案中，所述方法包括使用李斯特菌属疫苗载体。
[0071]在另一个实施方案中，本文提供了提高疫苗的免疫原性的方法，所述方法包括给受试者共同施用所述疫苗和基于李斯特菌属的佐剂，其中所述基于李斯特菌属的佐剂增强所述疫苗的免疫原性，由此提高所述疫苗的免疫原性。在一个实施方案中，所述方法能够治疗所述疫苗对其具有特异性的疾病。
[0072]在一个实施方案中，本文提供了以不依赖于抗原的方式增强对疾病的免疫应答的方法，所述方法包括给受试者施用基于李斯特菌属的佐剂。
[0073]在另一个实施方案中，所述基于李斯特菌属的佐剂是表达LLO的李斯特菌属菌株或LLO蛋白或其非溶血片段。在另一个实施方案中，所述基于李斯特菌属的佐剂是表达ActA的李斯特菌属菌株或ActA蛋白或其截短片段。在另一个实施方案中，基于李斯特菌属的佐剂单独使用，或者与其它佐剂相组合。在另一个实施方案中，所述其它佐剂是非核酸佐剂，包括铝佐剂、弗氏佐剂、MPLj^U、GM-CSF, QS21、SBAS2，含有CpG的寡核苷酸，编码免疫刺激性细胞因子的核苷酸分子，所述佐剂是或包含细菌促分裂原或细菌毒素。在另一个实施方案中，所述LLO蛋白或其溶血片段与所述疫苗混合或者化学偶联。
[0074]在一个实施方案中，所述疫苗选自:乙型肝炎病毒血液-衍生的疫苗、乙型肝炎病毒基因工程蛋白疫苗、HBV病毒载体疫苗、乙型肝炎病毒细菌载体疫苗、乙型肝炎病毒转基因植物疫苗、狂犬病病毒血液-衍生的疫苗、狂犬病病毒基因工程蛋白疫苗、狂犬病病毒载体疫苗、狂犬病病毒细菌载体疫苗和狂犬病病毒转基因植物疫苗，且所述DNA疫苗选自:乙型肝炎病毒DNA疫苗和狂犬病DNA疫苗。
[0075]在另一个实施方案中，所述基于李斯特菌属的佐剂单独使用，或者与其它佐剂相组合。
`[0076]在另一个实施方案中，本发明的佐剂与其它佐剂共同施用。在另一个实施方案中，在本发明的方法和组合物中使用的其它佐剂是，在另一个实施方案中，粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)蛋白。在另一个实施方案中，所述佐剂包含GM-CSF蛋白。在另一个实施方案中，所述佐剂是编码GM-CSF的核苷酸分子。在另一个实施方案中，所述佐剂包含编码GM-CSF的核苷酸分子。在另一个实施方案中，所述佐剂是皂苷QS21。在另一个实施方案中，所述佐剂包含皂苷QS21。在另一个实施方案中，所述佐剂是单磷酰脂质A。在另一个实施方案中，所述佐剂包含单磷酰脂质A。在另一个实施方案中，所述佐剂是SBAS2。在另一个实施方案中，所述佐剂包含SBAS2。在另一个实施方案中，所述佐剂是未甲基化的含有CpG的寡核苷酸。在另一个实施方案中，所述佐剂包含未甲基化的含有CpG的寡核苷酸。在另一个实施方案中，所述佐剂是免疫刺激性细胞因子。在另一个实施方案中，所述佐剂包含免疫刺激性细胞因子。在另一个实施方案中，所述佐剂是编码免疫刺激性细胞因子的核苷酸分子。在另一个实施方案中，所述佐剂包含编码免疫刺激性细胞因子的核苷酸分子。在另一个实施方案中，所述佐剂是或包含羽管糖苷(quill glycoside)。在另一个实施方案中，所述佐剂是或包含细菌促分裂原。在另一个实施方案中，所述佐剂是或包含细菌毒素。在另一个实施方案中，所述佐剂是或包含本领域已知的任意其它佐剂。每种可能性代表本发明的一个单独实施方案。
[0077]在一个实施方案中，本文提供了核酸分子，其编码本发明的佐剂。在另一个实施方案中，所述核酸分子被用于转化李斯特菌属，以便获得重组李斯特菌属。在另一个实施方案中，本文提供的用于转化李斯特菌属的核酸缺少毒力基因。在另一个实施方案中，整合进李斯特菌属基因组中的核酸分子携带无功能的毒力基因。在另一个实施方案中，所述毒力基因在重组李斯特菌属中发生突变。在另一个实施方案中，使用所述核酸分子将存在于李斯特菌属基因组中的内源基因灭活。在另一个实施方案中，所述毒力基因是ActA基因、inlC基因或PrfA基因。技术人员会理解，所述毒力基因可以是本领域已知的与重组李斯特菌属的毒力有关的任何基因。[0078]在一个实施方案中，在所述李斯特菌属菌株的染色体中缺少所述代谢基因、所述毒力基因等。在另一个实施方案中，在所述李斯特菌属菌株的染色体中和任意附加型遗传元件中缺少所述代谢基因、所述毒力基因等。在另一个实施方案中，在所述毒力菌株的基因组中缺少所述代谢基因、所述毒力基因等。在一个实施方案中，所述毒力基因在染色体中发生突变。在另一个实施方案中，所述毒力基因从染色体缺失。每种可能性代表本发明的一个单独实施方案。
[0079]在另一个实施方案中，本文提供的核酸和质粒不会给重组李斯特菌属赋予抗生素抗性。
[0080]在另一个实施方案中，“核酸分子”表示质粒。在另一个实施方案中，该术语表示整合载体。在另一个实施方案中，该术语表示包含整合载体的质粒。在另一个实施方案中，所述整合载体是位点特异性的整合载体。在另一个实施方案中，本发明的方法和组合物的核酸分子由本领域已知的任意类型的核苷酸组成。每种可能性代表本发明的一个单独实施方案。
[0081]在另一个实施方案中，“代谢酶”表示，在宿主细菌需要的营养物的合成中涉及的酶。在另一个实施方案中，该术语表示宿主细菌需要的营养物的合成所需的酶。在另一个实施方案中，该术语表示在宿主细菌所利用的营养物的合成中涉及的酶。在另一个实施方案中，该术语表示在宿主细菌的持续生长所需的营养物的合成中涉及的酶。在另一个实施方案中，所述酶是营养物的合成所必需的。每种可能性代表本发明的一个单独实施方案。
[0082]在另一个实施方案中，“稳定地维持”表示，在不存在选择(例如抗生素选择)的情况下，核酸分子或质粒维持10代，而没有可检测的丢失。在另一个实施方案中，所述时段是15代。在另一个实施方案中，所述时段是20代。在另一个实施方案中，所述时段是25代。在另一个实施方案中，所述时段是30代。在另一个实施方案中，所述时段是40代。在另一个实施方案中，所述时段是50代。在另一个实施方案中，所述时段是60代。在另一个实施方案中，所述时段是80代。在另一个实施方案中，所述时段是100代。在另一个实施方案中，所述时段是150代。在另一个实施方案中，所述时段是200代。在另一个实施方案中，所述时段是300代。在另一个实施方案中，所述时段是500代。在另一个实施方案中，所述时段是很多代。在另一个实施方案中，所述核酸分子或质粒在体外(例如在培养物中)稳定地维持。在另一个实施方案中，所述核酸分子或质粒在体内稳定地维持。在另一个实施方案中，所述核酸分子或质粒在体外和在体内稳定地维持。每种可能性代表本发明的一个单独实施方案。
[0083]在另一个实施方案中，本文提供的方法和组合物的代谢酶是氨基酸代谢酶，在另一个实施方案中，所述代谢酶是丙氨酸消旋酶。在另一个实施方案中，所述代谢酶是D-氨基酸转移酶。在另一个实施方案中，所述代谢酶会催化在重组李斯特菌属菌株中用于细胞壁合成的氨基酸的形成，在另一个实施方案中，所述代谢酶是丙氨酸消旋酶。
[0084]在另一个实施方案中，在李斯特菌属p60启动子控制下，表达编码所述代谢酶的基因。在另一个实施方案中，使用inlA(编码内化蛋白)启动子。在另一个实施方案中，使用hly启动子。在另一个实施方案中，使用ActA启动子。在另一个实施方案中，在任意其它革兰氏阳性的启动子控制下，表达所述整合酶基因。在另一个实施方案中，在任意其它在李斯特菌属中起作用的启动子的控制下，表达编码所述代谢酶的基因。技术人员会明白，可以使用其它启动子或多顺反子表达盒来驱动所述基因的表达。每种可能性代表本发明的一个单独实施方案。
[0085]在一个实施方案中，在本文提供的方法和组合物中使用的LLO是李斯特菌的L0。在一个实施方案中，用于衍生出LLO的李斯特菌属是单核细胞增生李斯特菌(Lm)。在另一个实施方案中，所述李斯特菌属是伊氏李斯特菌(Listeria ivanovii)。在另一个实施方案中，所述李斯特菌属是威氏李斯特菌(Listeria welshimeri)。在另一个实施方案中,所述李斯特菌属是斯氏李斯特菌(Listeria seeligeri)。
[0086]在一个实施方案中，所述LLO蛋白由在(SEQ ID NO:1)中阐述的下述核酸序列编码。
【权利要求】
1.一种在受试者中重建免疫应答的方法，所述方法包括下述步骤:给所述受试者施用活的减毒的李斯特菌属疫苗株。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述李斯特菌属菌株包含核酸分子，其中所述核酸分子包含编码含PEST多肽的第一开放读码框。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述李斯特菌属过表达所述含PEST多肽。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述含PEST多肽是非溶血性LLO蛋白或其免疫原性片段、ActA蛋白或其截短片段、或PEST氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组李斯特菌属包含基因组内化蛋白C(inlC)基因、ActA基因、PlcA基因、PrfA基因或PlcB基因的突变或缺失。
6.根据权利要求2所述的方法，其中所述核酸分子还包含编码代谢酶的第二开放读码框，其中所述代谢酶补足在所述重组李斯特菌属菌株的染色体中缺少的内源基因。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述李斯特菌属还包含编码代谢酶的第三开放读码框。
8.根据权利要求6所述的方法，其中由所述第二开放读码框编码的所述代谢酶是丙氨酸消旋酶。
9.根据权利要求7所述的方法，其中由所述第三开放读码框编码的所述代谢酶是D-氨基酸转移酶。
10.根据权利要求2所述的方法，其中所述核酸分子整合到李斯特菌属基因组内。
11.根据权利要求2所述的方法，其中所述核酸分子在质粒中，所述质粒在不存在抗生素选择的情况下稳定地维持在所述重组李斯特菌属疫苗株中。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组李斯特菌属菌株已经通过动物宿主进行传代。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者是成年人或儿童。
14.一种在受试者中促进细胞毒性治疗后的免疫应答恢复的方法，所述方法包括给所述受试者施用活的减毒的李斯特菌属疫苗株。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述李斯特菌属菌株包含核酸分子，其中所述核酸分子包含编码含PEST多肽的第一开放读码框。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述李斯特菌属过表达所述含PEST多肽。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述含PEST多肽是非溶血性LLO蛋白或其免疫原性片段、ActA蛋白或其截短片段、或PEST氨基酸序列。
18.根据权利要求14所述的方法，其中所述重组李斯特菌属包含基因组内化蛋白C(inlC)基因、ActA基因、PlcA基因、PrfA基因或PlcB基因的突变或缺失。
19.根据权利要求15所述的方法，其中所述核酸分子还包含编码代谢酶的第二开放读码框，其中所述代谢酶补足在所述重组李斯特菌属菌株的染色体中缺少的内源基因。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述李斯特菌属还包含编码代谢酶的第三开放读码框。
21.根据权利要求19所述的方法，其中由所述第二开放读码框编码的所述代谢酶是丙氨酸消旋酶。
22.根据权利要求20所述的方法，其中由所述第三开放读码框编码的所述代谢酶是D-氨基酸转移酶。
23.根据权利要求14所述的方法，其中所述核酸分子整合到李斯特菌属基因组内。
24.根据权利要求14所述的方法，其中所述核酸分子在质粒中，所述质粒在不存在抗生素选择的情况下稳定地维持在所述重组李斯特菌属疫苗株中。
25.根据权利要求14所述的方法，其中所述重组李斯特菌属菌株已经通过动物宿主进行传代。
26.根据权利要求14所述的方法，其中所述受试者是成年人或儿童。
27.一种提高疫苗的免疫原性的方法，所述方法包括下述步骤:给受试者共同施用所述疫苗和基于李斯特菌属的佐剂，其中所述基于李斯特菌属的佐剂增强所述疫苗的免疫原性，由此提高所述疫苗的免疫原性。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述基于李斯特菌属的佐剂是李斯特菌属菌株，所述菌株包含含有第一开放读码框的核酸分子，所述第一开放读码框表达含PEST多肽或其片段。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述李斯特菌属过表达所述含PEST多肽或其片段。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述含PEST多肽是非溶血性LLO蛋白或其免疫原性片段、ActA蛋白或其截短片段、或PEST氨基酸序列。
31.根据权利要求27所述的方法，其中所述李斯特菌属菌株包含基因组内化蛋白C(inlC)基因、ActA基因、`PlcA基因、PrfA基因或PlcB基因的突变或缺失。
32.根据权利要求28所述的方法，其中所述核酸分子包含编码代谢酶的第二开放读码框，其中所述代谢酶补足在所述重组李斯特菌属菌株的染色体中缺少的内源基因。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述李斯特菌属还包含编码代谢酶的第三开放读码框。
34.根据权利要求32所述的方法，其中由所述第二开放读码框编码的所述代谢酶是丙氨酸消旋酶。
35.根据权利要求33所述的方法，其中由所述第三开放读码框编码的所述代谢酶是D-氨基酸转移酶。
36.根据权利要求28所述的方法，其中所述核酸分子整合到李斯特菌属基因组内。
37.根据权利要求28所述的方法，其中所述核酸分子在质粒中，所述质粒在不存在抗生素选择的情况下下稳定地维持在所述重组李斯特菌属疫苗株中。
38.根据权利要求27所述的方法，其中所述重组李斯特菌属菌株已经通过动物宿主进行传代。
39.根据权利要求27所述的方法，其中所述受试者是成年人或儿童。
40.根据权利要求27所述的方法，其中所述基于李斯特菌属的佐剂单独使用，或者与其它佐剂相组合。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述其它佐剂是非核酸佐剂，包括铝佐剂、弗氏佐剂、10^、乳剂、61^3?、0321、38432，含有CpG的寡核苷酸，编码免疫刺激性细胞因子的核苷酸分子，所述佐剂是或包含细菌促分裂原或细菌毒素。
42.根据权利要求27所述的方法，其中所述方法能够治疗所述疾病。
43.一种在受试者中以不依赖于抗原的方式增强对疾病的免疫应答的方法，所述方法包括给所述受试者施用基于李斯特菌属的佐剂。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述基于李斯特菌属的佐剂是李斯特菌属菌株，所述菌株包含含有第一开放读码框的核酸分子，所述第一开放读码框表达含PEST多肽或其片段。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述李斯特菌属过表达所述含PEST多肽或其片段。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述含PEST多肽是非溶血性LLO蛋白或其免疫原性片段、ActA蛋白或其截短片段、或PEST氨基酸序列。
47.根据权利要求44所述的方法，其中所述李斯特菌属菌株包含基因组内化蛋白C(inlC)基因、ActA基因、PlcA基因、PrfA基因或PlcB基因的突变或缺失。
48.根据权利要求44所述的方法，其中所述核酸分子包含编码代谢酶的第二开放读码框，其中所述代谢酶补足在所述重组李斯特菌属菌株的染色体中缺少的内源基因。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述李斯特菌属还包含编码代谢酶的第三开放读码框。
50.根据权利要求48所述的方法，其中由所述第二开放读码框编码的所述代谢酶是丙氨酸消旋酶。
51.根据权利要求49所述的方法，其中由所述第三开放读码框编码的所述代谢酶是D-氨基酸转移酶。
52.根据权利要求44所述的方法，其中所述核酸分子整合到李斯特菌属基因组内。
53.根据权利要求44所述的方法，其中所述核酸分子在质粒中，所述质粒在不存在抗生素选择的情况下稳定地维持在所述重组李斯特菌属疫苗株中。
54.根据权利要求44所述的方法，其中所述重组李斯特菌属菌株已经通过动物宿主进行传代。
55.根据权利要求43所述的方法，其中所述受试者是成年人或儿童。
56.根据权利要求43所述的方法，其中所述基于李斯特菌属的佐剂单独使用，或者与其它佐剂相组合。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述其它佐剂是非核酸佐剂，包括铝佐剂、弗氏佐剂、10^、乳剂、61^3?、0321、38432，含有CpG的寡核苷酸，编码免疫刺激性细胞因子的核苷酸分子，所述佐剂是或包含细菌促分裂原或细菌毒素。
58.根据权利要求43所述的方法，其中所述方法能够治疗所述疾病。
【文档编号】A61K39/02GK103687611SQ201280022705
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年3月12日 优先权日:2011年3月11日
【发明者】J·罗思曼 申请人:阿德瓦希斯公司