一套用于单增李斯特菌检测的多核苷酸、方法和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一套生物工程技术领域的质粒分子，具体涉及一套用于单增李斯特菌 检测的多核苷酸、方法和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 单核细胞增生李斯特氏菌（L. monocytogenes)归属于李斯特菌属（Listeria)。单 核细胞增生李斯特菌是李斯特菌属中唯一对人致病的病菌，是一种重要的人兽共患和食品 卫生病原菌，该菌主要通过肉乳及其制品引起人的感染发病，能引起人和动物脑膜炎败血 症及孕妇流产等，故已引起世界多国相关部门的重视。
[0003]目前单核细胞增生李斯特氏菌的检测方法分为两类，一类是传统的培养及其改 进方法，依赖于生化与形态学特点，检测周期较长，可操作性差；一类是聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction，PCR)相关方法，包括普通PCR方法以及实时焚光PCR方法， 主要是针对单核细胞增生李斯特氏菌区别于李斯特菌属其它细菌的多个靶基因，选择特异 序列，建立PCR以及实时荧光PCR方法。单核细胞增生李斯特氏菌PCR相关检测方法近年 来发展迅速，由于其快速、灵敏、特异的特性，已经成为食源性病原微生物的可靠检测方法。
[0004] 质粒DNA标准物质是一套含有检测目的基因的特异性片段的重组质粒分子，在 PCR定性检测中可以作为阳性对照，在PCR定量分析中可以作为定量分析的标准品，构建定 量分析的标准曲线。目前质粒DNA分子作为基因检测的标准物质得到了越来越多的深入研 究和应用，但是针对单核细胞增生李斯特氏菌实时荧光PCR检测方法的质粒DNA标准物质 还是空白。在实际单核细胞增生李斯特氏菌实时荧光PCR时，各单位使用的多是自行设计 构建的质粒DNA分子作为标准品，其中的目的基因特异性片段各不相同，同时缺乏统一的 定值方法，质粒DNA分子定值准确度差，造成各实验室之间的检测结果差异极大，缺乏可比 性。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一套适用于单增李斯特菌实时荧光定量PCR检测的质粒 标准分子及其应用。
[0006] 本发明的另一目的是提供一套适用于致病型单增李斯特菌实时荧光定量PCR检 测的质粒标准分子及其应用。
[0007] 本发明的第一方面，提供了一套分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含单增李斯特 菌的内化素基因 InlA基因序列和/或单增李斯特菌的转录激活调节蛋白基因 prfA基因序 列。
[0008] 在另一优选例中，所述单增李斯特菌内化素基因 InlA的基因序列选自下组： [0009] (a)序列如SEQ ID NO. : 3所示的多核苷酸序列；
[0010] (b)核苷酸序列与SEQ ID NO. :3所示序列的同源性彡95% (较佳地彡98% )的 多核苷酸序列；
[0011] (C)序列与SEQ ID NO. :3所示多核苷酸完全匹配或完全互补并且长度为SEQ ID NO. : 3所示序列长度的20% -100% (较佳地50 % -100%，更佳地80 % -100%，最佳地 90% -100%，如95% )的多核苷酸序列；
[0012] (d)与（a)-(C)任一所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。
[0013] 在另一优选例中，所述单增李斯特菌的转录激活调节蛋白基因 prfA基因序列选 自下组：
[0014] (a)序列如SEQ ID NO. :1所示的多核苷酸序列；
[0015] (b)核苷酸序列与SEQ ID NO. : 1所示序列的同源性彡95% (较佳地彡98% )的 多核苷酸序列；
[0016] (c)序列与SEQ ID NO. :1所示多核苷酸完全匹配或完全互补并且长度为SEQ ID NO. :1所示序列长度的20% -100% (较佳地50 % -100%，更佳地80 % -100%，最佳地 90% -100%，如95% )的多核苷酸序列；
[0017] (d)与（a)-(C)任一所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。
[0018] 在另一优选例中，所述多核苷酸含有单增李斯特菌的转录激活调节蛋白基因 prfA 基因序列和单增李斯特菌的内化素基因 InlA序列，以及任选地连接两种基因序列的接头 序列。
[0019] 在另一优选例中，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO. :3所示。
[0020] 在另一优选例中，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO. : 1所示。
[0021] 本发明的第二方面，提供了一套分离的DNA构建物，所述DNA构建物中包含本发明 第一方面所述的多核苷酸，以及任选的标签序列、酶切序列、启动子序列和/或载体序列。
[0022] 在另一优选例中，所述DNA构建物中包含单增李斯特菌的转录激活调节蛋白基因 PrfA基因序列和单增李斯特菌的内化素 InlA的基因序列。
[0023] 在另一优选例中，所述DNA构建物为线性DNA构建物或环状DNA构建物。
[0024] 在另一优选例中，所述DNA构建物为质粒或表达载体。
[0025] 在另一优选例中，所述的质粒或表达载体作为单增李斯特菌检测的标准分子（质 粒标准分子）。
[0026] 在另一优选例中，所述质粒或表达载体的骨架质粒选自下组：pUC19, pUC18， pUC118，pUC119，pBlueScript II SK 和 pGEM。
[0027] 在另一优选例中，所述质粒的序列如SEQ ID NO :2或4所示。
[0028] 本发明的第三方面，提供了一套试剂盒，所述试剂盒中包括本发明第一方面所述 的多核苷酸或者本发明第二方面所述的DNA构建物。
[0029] 在另一优选例中，所述试剂盒中还包括引物对，所述引物对特异性扩增单增李斯 特菌内化素基因 InlA的基因序列。
[0030] 在另一优选例中，特异性扩增单增李斯特菌内化素基因 InlA的基因序列的所述 的引物对选自下组：
[0031] SEQ ID NO. :5 和 SEQ ID NO. :6 所示的引物对；
[0032] SEQ ID NO. :7 和 SEQ ID NO. :8 所示的引物对；
[0033] SEQ ID NO. :9 和 SEQ ID NO. : 10 所示的引物对；和
[0034] SEQ ID NO. : 11 和 SEQ ID NO. : 12 所示的引物对。
[0035] 在另一优选例中，所述试剂盒中还包括引物对，所述所述引物对特异性扩增单增 李斯特菌的转录激活调节蛋白基因 PrfA基因序列。
[0036] 在另一优选例中，特异性扩增单增李斯特菌的转录激活调节蛋白基因 PrfA基因 序列的引物对选自下组：
[0037] SEQ ID NO. : 14 和 SEQ ID NO. : 15 所示的引物对；
[0038] SEQ ID NO. : 16 和 SEQ ID NO. : 17 所示的引物对；和
[0039] SEQ ID NO. : 18 和 SEQ ID NO. : 19 所示的引物对。
[0040] 在另一优选例中，所述试剂盒中还包括选自下组的探针序列，所述探针序列如SEQ ID NO. : 13 所示。
[0041] 在另一优选例中，所述试剂盒中还包括选自下组的探针序列，所述探针序列如SEQ ID Na : 20 所示。
[0042] 本发明的第四方面，提供了如本发明第一方面所述的多核苷酸、本发明第二方面 所述的DNA构建物、或本发明第三方面所述的试剂盒的用途，其特征在于，用于单增李斯特 囷的检测。
[0043] 在另一优选例中，所述检测为非诊断或治疗目的。
[0044] 在另一优选例中，所述检测为荧光定量PCR检测。
[0045] 本发明的第五方面，提供了一套单增李斯特菌实时荧光定量PCR检测方法，所采 用的标准物质是如本发明第一方面所述的多核苷酸或本发明第二方面所述的DNA构建物。
[0046] 本发明的第六方面，提供了一套多核苷酸产品，所述产品包括：
[0047] (i)单增李斯特菌标准品，所述的标准品选自：本发明第一方面所述的多核苷酸 或者本发明第二方面所述的DNA构建物；
[0048] (ii)特异性扩增单增李斯特菌序列的引物对，所述引物对为：
[0049] SEQ ID NO. :5和SEQ ID NO. :6所示的序列构成的引物对；和/或
[0050] SEQ ID Nd : 14和SEQ ID Nd : 15所示的序列构成的引物对。
[0051] 在另一优选例中，所述的产品为多核苷酸的组合（combination)，较佳地所述组分 ⑴和（ii)是各自独立的。
[0052] 在另一优选例中，所述的产品为试剂盒形式。
[0053] 本发明的第七方面，提供了一套单增李斯特菌的质粒标准分子的制备方法，包括 以下步骤：
[0054] ①人工合成单增李斯特菌的内化素 InlA基因序列和/或单增李斯特菌的转录激 活调节蛋白基因 prfA基因序列，所述单增李斯特菌的转录激活调节蛋白基因 prfA基因序 列和所述内化素 InlA表达基因序列分别如SEQ ID NO.