一种利用荧光pcr技术对小鼠的分型鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于小鼠分型鉴定方法领域，特别涉及一种利用荧光PCR技术对小鼠的分 型鉴定方法。
【背景技术】
[0002] 基因打靶技术自诞生以来一直是研究基因功能的重要手段之一，揭示了许多重要 基因的生物学功能。除此之外，研究人员也憧憬能利用基因打靶技术对特定基因进行敲除 或者修饰，从而达到治疗疾病或者改善畜禽生产性状的目的。但早期基因打靶技术效率极 低，难以真正应用到医疗或者畜禽改良实践中。CRISPR/Cas9系统作为一种新兴的基因定点 编辑技术逐渐成熟并在多个动植物物种中成功得到应用，极大地促进了基因功能的研究。 CRISPR/Cas系统广泛分布于细菌和古生菌基因组中，是在进化过程中形成的一种适应性 免疫系统，可以降解入侵病毒或质粒DNA。
[0003] CRISPR/Cas系统的出现为基因工程提供了一个强有力的应用新工具，它将给基 因组定向编辑的研究和应用领域带来突破性的技术革命，特别是在基因功能解析、人类疾 病靶向治疗等应用中有巨大的潜力和广阔的前景；有望加速重要农作物水稻、小麦性状改 良与分子定向育种。更令人鼓舞的是，其操作简单、实验周期短、节约成本，有利于在普通 实验室推广这一技术，因此，CRISPR/Cas系统的广泛应用将对生物学研究产生深远的影 响。利用CriSpr/CaS9技术的基因敲除小鼠也越来越多，传统的对敲除小鼠进行的分型的 方法是通过T7E1酶切来鉴定。这种方法首先通过PCR技术扩增出大量的需要鉴定位点的 模板，再通过一个退火的过程会在杂合链上形成一个缺口，最后使用T7E1酶切并观察琼脂 糖电泳PCR产物条带来鉴定小鼠的基因型。然而，这种方法过于繁琐，需要经过一段时间退 火才可以进行下一步实验；使用酶切方法，如果酶切的效率低也会产生假阴性的结果；使 用琼脂糖电泳，分辨率较低。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种利用荧光PCR技术对小鼠的分型鉴定方 法，经过PCR扩增后通过产物大小及峰图直观分辨小鼠类型。
[0005] 本发明的一种利用荧光PCR技术对小鼠的分型鉴定方法，包括：
[0006] ⑴小鼠饲养和样本采集：
[0007] SPF级C57BL/6J小鼠（上海斯莱克实验动物有限公司），SPF级利用Crispr/Cas9 系统敲除mircoRNA的C57BL/6J小鼠（中科院实验动物中心构建），得到的小鼠为Founder 小鼠；
[0008] 将2只Founder小鼠与C57BL/6J小鼠杂交，得到Fl代小鼠，Fl代杂合小鼠得到 F2代；
[0009] (2) DNA抽取：取上述Fl代小鼠 Icm尾组织（一20°C保存备用），然后提取DNA ;
[0010] 采用动物基因组DNA抽提试剂盒（生工生物工程有限公司），按照说明书进行抽提 得到DNA，以0. 8%琼脂糖凝胶电泳确定DNA质量和浓度；
[0011] ⑶引物设计：
[0012] 在Crispr/Cas9系统敲除的基因位点区域设计一对PCR引物（根据NCBI数据库 中 C57BL/6J小鼠的 microRNA 的序列，使用 Primer3 在线软件（http://frodo. wi. mit. edu/ primerf/)进行初步引物设计，再利用〇lig〇6人工设计，然后合成（上海生工生物工程技术 服务有限公司）），且在上游引物的5'端使用FAM荧光修饰，得到荧光引物；
[0013] (4)荧光PCR技术鉴定：
[0014] 将荧光引物对步骤（2)中的DNA进行PCR扩增（对Fl和F2代DNA进行相同条件 的扩增），然后将PCR产物与分子内标（携带ROX的已知片段大小的DNA)混合，在测序仪上 经过电泳分离，通过使用分子量内标法，进行鉴定。
[0015] 其中鉴定过程中使用Genemapper软件计算出PCR产物大小，从而达到鉴定小鼠基 因型的目的。
[0016] 所述步骤（1)中 mircoRNA 为 mircoRNA505。
[0017] 所述步骤（3)中引物为：L :AAACCAGCAAGTGTTGACGC ;R :CCCTGTTTGTCACTTGCAGA。
[0018] 所述步骤⑶中FAM为6' FAM。
[0019] 所述步骤⑷中PCR扩增具体为：3 μ LDNA加入到Taq酶体系中，其中Taq酶体 系包含 1.5yL200nM 上下游引物、1.5yL 0.25mM 的 dNTP，5yL 10XPCR Buffer，lyl^9l 单位Taq酶，并使用矿物油覆盖；同时设阴性对照，反应程序为：95°C变性5min ;94°C变性 30s，56°C复性 lmin30s，72°C延伸 lmin，35 个循环，72°C，lOmin。
[0020] 所述步骤⑷中在测序仪上经过电泳分离为：在377测序仪上经过聚丙烯酰胺凝 胶电泳分离，其中测试仪功率为30W，分离时间为2h。
[0021] 所述步骤（4)中分子内标为携带ROX的已知片段大小的DNA，其中已知片段大小的 DNA的片段大小为79、105、131、151。
[0022] 步骤（4)中鉴定具体：使用GeneSCanTM672将测序仪上电泳分离的结果进行数据 采集，然后使用Genemapper软件对采集数据进行分析，分析PCR产物检测峰的数目及位置， 计算出PCR产物大小，进行鉴定。
[0023] 检测峰的数目为单峰代表纯合，双峰代表杂合即为单敲小鼠，再根据检测峰的位 置鉴定野生和双敲小鼠。
[0024] 鉴定双敲（单峰，峰的位置居于左侧，表示产物长度较小），单敲（双峰，左侧峰与 双敲小鼠一致，右侧峰与野生型小鼠一致），野生型（单峰，峰的位置居于右侧，表示产物长 度较长）小鼠。
[0025] 不同位置代表不同PCR产物大小，所述野生老鼠产物大小为112bp ;双敲小鼠产物 大小为89bp ;单敲小鼠产物大小为89bp/112bp (如图1)。
[0026] 通过使用分子量内标法具体指：利用携带ROX(红色荧光染料）的已知片段大小 DNA的四种DNA混合物作为内参，四种DNA片段大小分别为79、105、131、151。
[0027] 本发明利用荧光PCR技术方法可以简洁、方便、准确地鉴定Crispr/CaS9系统敲除 mircoRNA的小鼠。利用引物设计软件在敲除位点区域设计一对PCR引物，并且在上游引物 的5'端使用FAM荧光修饰。在经过PCR的扩增后，将PCR产物与已知片段大小的ROX混合， 在377测序仪上经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。通过已知片段大小的ROX使用分子量内标 法，使用Genemapper软件计算出PCR产物大小，从而达到鉴定小鼠基因型的目的。其分辨 率远远大于琼脂糖电泳。
[0028] 有益效果
[0029] 本发明利用荧光PCR技术准确直接地鉴定出Crispr/Cas9系统敲除mircoRNA的 小鼠，使用一对在上游引物5'端用FAM荧光修饰的在敲除位点区域特异性的荧光引物，经 PCR扩增后通过产物大小及峰图直观的分辨出小鼠类型。而传统的对敲除小鼠进行的分型 的方法是通过T7E1酶切来鉴定，这种方法首先通过PCR技术扩增出大量的需要鉴定位点的 模板，再通过一个退火的过程会在杂合链上形成一个缺口，最后使用T7E1酶切并观察琼脂 糖电泳PCR产物条带来鉴定小鼠的基因型。然而，这种方法过于繁琐，需要经过一段时间退 火才可以