准分子（I. 69 X IO6Copies/ μ L、I. 69 X IO5Copies/ μ L、 I. 69 X IO4Copies/ μ L、I. 69 X IO3Copies/ μ L、I. 69 X IO2Copies/ μ L、I. 69 X IO1Copies/ μ L、I. 69 X 10°copies/ μ L)将不同浓度的质粒标准分子分别作为模板，按照文献中的方法 进行实时荧光PCR扩增。每个反应重复三次，根据不同浓度模板扩增的Ct值与浓度之间的 关系，建立标准曲线。
[0264] 实验结果
[0265] 1、本实例中对数十对引物进行了测试，实验结果表明有4对引物能够针对单增李 斯特菌的内化素 InlA的基因序列进行有效扩增，有3对引物能够针对单增李斯特菌的转录 激活调节蛋白基因 prfA基因序列进彳丁有效扩增。最终获得的能够成功扩增目标序列的引 物和探针序详见表15。
[0266] 表15实验中采用的引物和探针序列
[0268] 针对单增李斯特菌的内化素 InlA的基因序列，引物对1的检测效果最好，特异性 强，扩增后没有非特异性的条带出现，检测灵敏度最高，最低可检测I. 85c〇pieS/ μ L的目 标序列；引物对2和3的灵敏度$父低，能够检测到1. 85 X IO2Copies/ μ L的目标序列；引物 对4能够检测到1. 85 X IO1c0Pies/ μ L的目标序列，但是特异性较差，有非特异性条带出 现。
[0269] 针对单增李斯特菌的转录激活调节蛋白基因 PrfA基因序列，引物对5的检测 效果最好，特异性强，扩增后没有非特异性的条带出现，检测灵敏度最高，最低可检测 I. 69copies/ μ L的目标序列；引物对6的灵敏度较低，能够检测到I. 69Χ IO2Copies/ μ L的 目标序列；引物对7能够检测到I. 96X IO1c0Pies/μ L的目标序列，但是特异性较差，有非 特异性条带出现。
[0270] 2、质粒标准分子LYOl在实时荧光PCR检测中的应用
[0271] 使用引物对1，分别以不同浓度的质粒标准分子LYOl(如：1.85X 106copies/yL、 1. 85 X IO5Copies/ μ L、1. 85 X IO4Copies/ μ L、1. 85 X IO3Copies/ μ L、1. 85 X IO2Copies/ μ L、I. 85 X IO1Copies/ μ L、I. 85 X 10°copies/ μ L)作为标准品建立实时荧光PCR的标准曲 线。建立的标准曲线见图3,相关系数达到0. 999,线性良好，表明质粒标准分子LYOl适合 应用于实时荧光PCR检测，可作为实时荧光PCR扩增单增李斯特菌的阳性标准物质。
[0272] 使用引物对5,分别以不同浓度的质粒标准分子LY02 (如：1. 69X IO6Copies/ μ L、 1. 69 X IO5Copies/ μ L、1. 69 X IO4Copies/ μ L、1. 69 X IO3Copies/ μ L、1. 69 X IO2Copies/ μ L、I. 69 X IO1Copies/ μ L、I. 69 X 10°copies/ μ L)作为标准品建立实时荧光PCR的标准曲 线。建立的标准曲线见图6,相关系数达到0. 998,线性良好，表明质粒标准分子LY02适合 应用于实时荧光PCR检测，可作为实时荧光PCR扩增单增李斯特菌的阳性标准物质。
[0273] 在实际单增李斯特菌检测时，可利用该线性良好引物对制作的标准曲线，通过实 验荧光PCR方法检测出待测样品中单增李斯特菌特定基因的拷贝数，并可根据单增李斯特 菌特定基因的拷贝数与细菌总数之间的线性关系，换算出单增李斯特菌的具体个数。由于 目前针对单增李斯特菌实时荧光PCR检测方法的标准物质的研发仍是空白，在实际单增李 斯特菌实时PCR检测时，各单位使用的多是自行设计构建的质粒DNA分子作为标准品，其中 的目的基因特异性片段各不相同，同时缺乏统一的定值方法，质粒DNA分子定值准确度差， 造成各实验室之间的检测结果差异极大，缺乏可比性、有效性和可靠性。因此，本质粒标准 分子可以解决实时荧光PCR检测单增李斯特菌时缺乏标准物质的难题，适用于多种扩增单 增李斯特菌的实时荧光PCR方法，保证检测结果的可比性，为单增李斯特菌实时荧光PCR方 法检测提供生物计量技术支持。
[0274] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【主权项】
1. 一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列选自下组： (a) 序列如SEQIDNO. :3或1所示的多核苷酸序列； (b) 核苷酸序列与SEQIDNO. :3或1所示序列的同源性彡95% (较佳地彡98% )的 多核苷酸序列； (c) 序列与SEQIDNO. :3或1所示多核苷酸完全匹配或完全互补并且长度为SEQID NO. :3或1所示序列长度的20%-100% (较佳地50%-100%，更佳地80%-100%，最佳地 90% -100%，如95% )的多核苷酸序列； (d) 与（a)-(c)任一所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。2. -种分离的DNA构建物，其特征在于，所述DNA构建物中包含权利要求1所述的多核 苷酸，以及任选的标签序列、酶切序列、启动子序列和/或载体序列。3. 如权利要求2所述的DNA构建物，其特征在于，所述DNA构建物为线性DNA构建物或 环状DNA构建物；优选地所述DNA构建物为质粒或表达载体；更优选地，所述质粒或表达载 体的序列如SEQIDNO:4或2所示。4. 一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括权利要求1所述多核苷酸或者权利要 求2所述的DNA构建物。5. 如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括引物对，所述引物对 特异性扩增单增李斯特菌内化素基因InlA的基因序列和/或特异性扩增单增李斯特菌的 转录激活调节蛋白基因PrfA基因序列；优选地特异性扩增单增李斯特菌内化素基因InlA 的基因序列的所述的引物对选自下组： SEQIDNO. :5和SEQIDNO. :6所示的引物对； SEQIDNO. :7和SEQIDNO. :8所示的引物对； SEQIDNO. :9和SEQIDNO. : 10所示的引物对；和SEQIDNO. : 11 和SEQIDNO. : 12 所示的引物对； 特异性扩增单增李斯特菌的转录激活调节蛋白基因PrfA基因序列的引物对选自下 组： SEQIDNO. : 14 和SEQIDNO. : 15 所示的引物对； SEQIDNO. : 16和SEQIDNO. : 17所示的引物对；和 SEQIDNO. : 18 和SEQIDNO. : 19 所示的引物对。6. 如权利要求1所述的多核苷酸、权利要求2所述的DNA构建物、或权利要求4所述的 试剂盒的用途，其特征在于，用于单增李斯特菌的检测。7. -种单增李斯特菌实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所采用的标准物质是 如权利要求1所述的多核苷酸或权利要求2所述的DNA构建物。8. -种多核苷酸产品，其特征在于，所述产品包括： (i) 单增李斯特菌标准品，所述的标准品选自：权利要求1所述多核苷酸或者权利要求 2所述DNA构建物； (ii) 特异性扩增单增李斯特菌序列的引物对，所述引物对为： SEQIDNO. :5和SEQIDNO. :6所示的序列构成的引物对；和/或SEQIDNO. : 14和SEQIDNO. : 15所示的序列构成的引物对。9. 一种单增李斯特菌的质粒标准分子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： ① 人工合成单增李斯特菌的内化素InlA的基因序列和/或单增李斯特菌的转录激活 调节蛋白基因PrfA基因序列，所述单增李斯特菌的转录激活调节蛋白基因prfA基因序列 和所述单增李斯特菌的内化素InlA的基因序列分别如SEQIDNO. : 1和SEQIDNO:3所 示； ② 将步骤①所得基因序列克隆至克隆载体上，得到单增李斯特菌的质粒标准分子。10.如权利要求9所述的单增李斯特菌的质粒标准分子的制备方法，其特征在于，步骤 @所述克隆载体为口1](：1941](：1841](：118邛1](：1194811165(^1口七1151(或口6￡]\1。
【专利摘要】本发明公开了一种用于单核细胞增生李斯特菌检测的多核苷酸、方法和试剂盒。具体地本发明中公开了可用作单核细胞增生李斯特菌实时荧光PCR检测标准分子的多核苷酸和DNA构建物LY01和LY02。本发明的质粒标准分子解决了单核细胞增生李斯特菌实时荧光PCR检测中标准物质缺乏的难题，保证单核细胞增生李斯特菌实时荧光PCR方法检测结果的可比性，为单核细胞增生李斯特菌实时荧光PCR方法检测提供了可靠质量控制方法。
【IPC分类】C12Q1/04, C12N15/11, C12Q1/68, C12N15/10
【公开号】CN105177127
【申请号】
【发明人】李妍, 刘刚, 许丽, 梁文, 闻艳丽, 李兰英, 徐勤, 任淑贞
【申请人】上海市计量测试技术研究院
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年8月21日