: 1和SEQ ID NO :3所示；
[0055] ②将步骤①所得基因序列克隆至克隆载体上，得到单增李斯特菌的质粒标准分 子。
[0056] 在另一优选例中，所述步骤②所述克隆载体为pUC19, pUC18, pUC118, pUC119， pBlueScript II SK 或 pGEM。
[0057] 在另一优选例中，所述步骤②所述克隆载体为pUC19。
[0058] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附图说明】
[0059] 图1是本发明质粒标准分子LYOl的图谱。
[0060] 图2是本发明所得质粒标准分子LYOl稳定性检测结果图。
[0061] 图3是利用本发明质粒标准分子LYOl建立的实时荧光PCR标准曲线。
[0062] 图4是本发明质粒标准分子LY02的图谱。
[0063] 图5是本发明所得质粒标准分子LY02稳定性检测结果图。
[0064] 图6是利用本发明质粒标准分子LY02建立的实时荧光PCR标准曲线。
【具体实施方式】
[0065] 本发明人通过广泛而深入的研究，获得一段能够用于单增李斯特菌PCR检测的多 核苷酸序列以及与之相配合的引物对，实验结果表明，采用合适的骨架质粒将所述多核苷 酸序列制备为标准质粒分子，并配合本发明的引物对进行实时荧光PCR检测，具有极佳的 特异性和灵敏度，并且稳定性良好。
[0066] 本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的单增李斯特菌实时荧光PCR检测 方法中缺乏阳性标准品和阳性标准品配置的问题，提供了一套适用于单增李斯特菌实时荧 光PCR检测的质粒标准分子以及该质粒标准分子的构建方法、定量方法和应用。
[0067] 检测菌株
[0068] 单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes，LM)是食品卫生上重要的病原菌，它 广泛存在于自然界，可导致人和动物脑膜炎流产败血症等，病死率高达30 %~70 %，是目 前人类最重要的食物源性病原菌之一，WHO将其列为20世纪90年代食品中四大致病菌之 一，也被列为21世纪对中国人卫生健康具有重大影响的12种病原微生物之一。
[0069] 单增李斯特菌转录激活调节蛋白基因 prfA基因（对应检测质粒标准物质LY02) 是单增李斯特菌检测的毒力因子。研究资料表明，编码内化素的Inl基因是LM最重要的致 病基因，其位点在单增李斯特菌的染色体内，缺少即无致病性，因此，它们可以作为单增李 斯特菌菌种检测的关键基因。
[0070] 实时荧光PCR检测单增李斯特菌的原理
[0071] 采用实时荧光PCR技术可特异性扩增单增李斯特菌基因组DNA中内化素 InlA基 因序列或单增李斯特菌转录激活调节蛋白基因 PrfA基因序列，设计针对以上靶基因的引 物和两端标记荧光的探针，扩增测试样品DNA。实时荧光PCR可以通过检测荧光信号的增加 来实时监测PCR产物。与此同时，用相同的引物、探针和条件扩增已知浓度的阳性标准物质 (或阳性标准分子）。PCR方法中，阳性标准物质（或阳性标准分子）可以作为阳性对照； 实时荧光PCR中，阳性标准物质（或阳性标准分子）可以构建稳定的标准曲线，根据标准曲 线可分别计算出样品中对应基因的绝对含量（拷贝数或浓度）。
[0072] 标准物质
[0073] 标准物质是具有一套或多种足够均匀和很好确定了的特性值，用以校准设备，评 价测量方法或给材料赋值的材料或物质。
[0074] 质粒标准分子
[0075] 本发明中涉及两种检测单增李斯特菌的特异性序列并在此基础上设计了两种质 粒标准分子，一种单增李斯特菌的特异性序列是单增李斯特菌内化素 InlA基因，长度为 2403bp ;另一套单增李斯特菌的特异性序列是单增李斯特菌转录激活调节蛋白基因 prfA 基因，长度为714bp。
[0076] 在本发明的一个优选地实施方式中，本发明提供了一套单增李斯特菌的质粒标准 分子，该质粒标准分子包含单增李斯特菌转录激活调节蛋白基因 PrfA基因序列，所述单增 李斯特菌转录激活调节蛋白基因 PrfA基因序列如序列表中SEQ ID NO :1所示：
[0078] 本发明的质粒标准分子，较佳地含有单增李斯特菌的PCR检测的靶基因单增李斯 特菌转录激活调节蛋白基因 PrfA基因序列。
[0079] 本发明中所述的单增李斯特菌转录激活调节蛋白基因 prfA基因，在DNA、RNA和蛋 白质的合成中起作用，它可作为单增李斯特菌检测的一套靶基因，所述单增李斯特菌转录 激活调节蛋白基因 PrfA基因的序列较佳的如SEQ ID NO :1所示。
[0080] 本发明所述的质粒标准分子的序列较佳的如SEQ ID NO :2所示，其中第414位到 第1127位为prfA基因序列：
CN 105177127 A 说明书 6/21 页
[0083] 在本发明的另一个优选地实施方式中，本发明提供了一套单增李斯特菌的质粒标 准分子，该质粒标准分子包含单增李斯特菌内化素 InlA表达基因序列，所述单增李斯特菌 内化素 InlA表达基因序列如序列表中SEQ ID NO :3所示：
[0084] CN 105177127 A 说明书 7/21 页
[0086] 本发明的质粒标准分子，较佳地含有单增李斯特菌的PCR检测的靶基因单增李斯 特菌内化素 InlA表达基因序列。
[0087] 本发明中所述的单增李斯特菌内化素 InlA表达基因，在DNA、RNA和蛋白质的合成 中起作用，它可作为单增李斯特菌检测的一套靶基因，所述单增李斯特菌内化素 InlA的序 列较佳的如SEQ ID NO :3所示。
[0088] 在本发明的另一个较佳的实施方式中，本发明所述的质粒标准分子的序列如SEQ ID NO :4所示，其中第414位到第2816位为InlA基因序列：
[0089] CN 105177127 A 说明书 8/21 页
[0092] 在本发明的另一较佳的实施方式中，根据本发明的质粒标准分子中含有单增李斯 特菌转录激活调节蛋白基因 prfA基因序列和单增李斯特菌内化素 InlA基因序列。较佳地， 所述PrfA序列如SEQ ID NO. : 1所示，所述InlA序列如SEQ ID NO. : 3所示。
[0093] 本发明中如上所述单增李斯特菌的质粒标准分子的定量方法，其包括以下步骤：
[0094] ①提取质粒标准分子；
[0095] ②根据步骤①所得的质粒标准分子的碱基组成和序列长度，计算质粒标准分子中 的磷元素的含量；
[0096] ③配制梯度浓度的磷标准溶液，并用此标准溶液作出高分辨电感耦合等离子体发 射质谱的标准曲线；
[0097] ④高分辨电感耦合等离子体发射质谱检测质粒标准分子溶液，并根据步骤③所得 的标准曲线得出质粒标准分子溶液的磷含量；
[0098] ⑤根据步骤④所得的质粒标准分子溶液的磷含量和步骤②所得的质粒标准分子 中的磷元素的含量，计算出质粒标准分子的浓度。
[0099] 其中步骤所述③高分辨电感耦合等离子体发射质谱检测的条件如下：冷却气流 量较佳地为l〇L/min~25L/min，最佳地为16. 86L/min，辅助气流量较佳地为0. 5L/min~ 3. OL/min，最佳地为0. 88L/min，雾化气流量为较佳地为0. 5L/min~2. 43L/min，更佳地为 I. 123L/min，功率较佳地为1200W~1400W，最佳地为1350W。
[0100] 本发明所述质粒标准分子的定量方法较佳地包括紫外分光光度法和高分辨电感 耦合等离子体质谱（HR-ICP-MS)。
[0101] 具体实施说明：
[0102] 本发明所述质粒标准分子的定量方法较佳地包括紫外分光光度法和高分辨电感 耦合等离子体质谱（HR-ICP-MS)。
[0103] 其中紫外分光光度法对质粒标准分子定量方法较佳地包括以下步骤：
[0104] ①提取质粒标准分子；
[0105] ②用TE缓冲液使紫外分光光度计校正为零点；
[0106] ③取适量DNA(根据仪器的需要）至比色杯中（nanodrop直接点在检测区域），记 录仪器读数。
[0107] ④若可直接读出DNA浓度则直接记录；若不可，则记录样品在260nm和280nm的光 密度，DNA样品的浓度为0D260 X核酸稀释倍数X 50,浓度单位为ng/ μ L。
[0108] (2) HR-ICP-MS对质粒标准分子定量方法较佳地包括以下步骤：
[0109] ①提取质粒标准分子；
[0110] ②根据质粒标准分子的碱基组成和序列长度，分别计算各质粒标准分子的磷元素 的含量；
[0111] ③配制梯度浓度的磷标准溶液，并用此标准溶液作出HR-ICP-MS的标准曲线。
[0112] ④HR-ICP-MS检测质粒标准分子，并根据标准曲线得出质粒标准分子的磷含量。
[0113] ⑤根据质粒标准分子的磷含量计算出质粒标准分子的浓度。
[0114] 本发明还提供