量数据，如果测定方差无显著性差异，则应满足下式 的统计要求。
[0167] 其中组间差方和计算公式为： CN 105177127 A 说明书 14/21 页
[0169] 组内差方和计算见公式为：
[0171] V1= m-l (组间自由度）
[0172] V2= N-m(组内自由度）。
[0173] 实验结果：
[0174] 1、质粒标准分子LYOl和LY02的均匀性检验结果分别如表1 一 4所示
[0175] 表1质粒标准分子LYOl均匀性检验数据（单位：ng/ μ L)
[0177] 表2质粒标准分子LYOl的均匀性统计结果
[0179] LYOl的均匀性统计结果见表2,在95%置信水平下，F值小于FQ.Q5 (14, 30)，证明该 质粒标准分子LYOl是均匀的，符合《JJG1006-94 -级标准物质技术规范》均匀检验合格要 求。
[0180] 表3质粒标准分子LY02均匀性检验数据（单位：ng/ μ L)
[0181] CN 105177127 A 说明书 15/21 页
[0185] LY02的均匀性统计结果见表3,在95%置信水平下，F值小于FQ.Q5 (14, 30)，证明该 质粒标准分子LY02是均匀的，符合《JJG1006-94 -级标准物质技术规范》均匀检验合格要 求。
[0186] 实施例3质粒标准分子LYOl和LY02的稳定性考察
[0187] 稳定性是指在特定的时间间隔和贮存条件下，标准物质的特性值保持在规定范围 内的能力。稳定性是标准物质的基本属性，用于描述标准物质的特性随时间变化的性质，BP 描述标准物质特性的时间分布特征。在标准物质的研制过程中必须进行稳定性评估。稳 定性评估不但能评估与材料稳定性相关的测量不确定度，而且能明确合适的保存和运输条 件。稳定性良好的质粒标准分子，其特性值在合适的保存和运输条件下不会随着时间的推 移而改变，检测结果不会受其不稳定性的影响，保证了检测结果的可靠性。
[0188] 实验试剂TE缓冲液（ρΗ7· 5)。实验仪器Nanodrops ND-2000。
[0189] 实验方法：
[0190] 采用经典稳定性研究对质粒标准分子的稳定性进行考察，即同时制备的样品在相 同条件下随着时间的推移进行测量。
[0191] 1、在质粒标准分子制备完成后的第0个月、0. 5个月、1个月、2个月、4个月、7个 月、10个月、12个月对制备的质粒标准分子（_20°C保存）随机抽取3瓶，每个样品重复测定 3次，取平均值，进行长期稳定性考察。本研究采用了紫外分光光度法对质粒标准分子进行 了跟踪考察。
[0192] 2、对稳定性检测数据进行评估，判断稳定性考察结果。具体考察方法如下：
[0193] 直线斜率可用下式计算： CN 105177127 A 说明书 16/21 页
[0195] 式中=X1 --第i个时间点；Y1--第i个时间点的观测值；f 一一所有时间点的 平均值；F-一所有观测值的平均值。
[0196] 截距可由下式计算：
[0198] 直线上每点的标准偏差可用下式计算：
[0200] 式中=X1-一第i个时间点；Y1 -一第i个时间点的观测值；β i，β。一一回归系数； η--测量系数。
[0201] ^的标准偏差由下式给出：
[0203] 基于P1的标准偏差，可用t_检测进行以下判断：即若|β」 则表明斜率不显著，没有观察到不稳定性。
[0204] 实验结果：
[0205] 1、质粒标准分子LYOl稳定性考察结果如表5和图2所示，：
[0206] 表5质粒标准分子LYOl的稳定性监测数据（单位：ng/ μ L)
[0208] 统计结果如表6所示。
[0209] 表6质粒标准分子LYOl的稳定性统计结果
[0210] CN 105177127 A 说明书 17/21 页
[0212] 由统计结果可知，质粒标准分子LYOl在-20度条件下保存12个月是稳定的。
[0213] 2、质粒标准分子LY02稳定性考察结果如表7和图5所示：
[0214] 表7质粒标准分子LY02的稳定性监测数据（单位：ng/ μ L)
[0216] 统计结果如表8所示。
[0217] 表8质粒标准分子LY02的稳定性统计结果
[0219] 由统计结果可知，质粒标准分子LY02在_20°C条件下保存12个月是稳定的。
[0220] 实验例4用紫外分光光度法对质粒标准分子进行定量
[0221] 实验试剂TE缓冲液（pH7. 5)。实验仪器Nanodrops ND-2000。
[0222] 实验方法包括以下步骤：
[0223] I、用TE缓冲液使紫外分光光度计校正为零点；
[0224] 2、取实施例制备所得DNA溶液1 μ L，直接点在检测区域，记录仪器读数；
[0225] 3、直接读出DNA浓度，浓度单位为ng/ μ L。
[0226] 4、每个样品测试八次，取平均值。
[0227] 实验结果：
[0228] 1、经过紫外分光光度法定值，质粒标准分子LYOl的浓度如表9所示：
[0229] 表9紫外分光光度法定值结果（单位：ng/ μ L)
[0231] 2、经过紫外分光光度法定值，质粒标准分子LY02的浓度如表5所示：
[0232] 表10紫外分光光度法定值结果（单位：ng/ μ L)
[0234] 实施例5用HR-ICP-MS对质粒标准分子LYOl和LY02进行定量
[0235] 实验试剂为P标准溶液（NIST，SRM3139a)。实验仪器为：电感耦合等离子体发射 质谱仪（Thermofi sher element2) 〇
[0236] 实验方法包括以下步骤：
[0237] 1、根据质粒标准分子的碱基组成和序列长度，分别计算其中磷元素的含量；
[0238] 2、HR-ICP-MS实验参数为：冷却气流量16. 86L/min，雾化气流量为I. 123L/min，辅 助气流量为〇. 99L/min，功率1350W。
[0239] 3、配制梯度浓度的磷标准溶液（0、l、2、3、4、5g/L)，并用此标准溶液作出 HR-ICP-MS的标准曲线；
[0240] 4、将质粒标准分子稀释3000倍，HR-ICP-MS检测稀释后的质粒标准分子，并根据 标准曲线得出稀释后的质粒标准分子的磷含量；
[0241] 5、根据测得的磷含量和稀释倍数计算出质粒标准分子的浓度；
[0242] 6、每个样品测试八次，取平均值。
[0243] 实验结果：
[0244] 1、经计算，质粒标准分子LYOl的磷元素的含量为10. 21 %。经过HR-ICP-MS定值 得到质粒标准分子磷元素含量数据如表11所示，稀释倍数为3000,换算得到质粒分子的质 量浓度，如表12所示。
[0245] 表11质粒标准分子LYOl的磷元素含量（单位：μ g/L)
[0246] CN 105177127 A 说明书 19/21 页
[0247] 表12质粒标准分子LYOl的质量浓度结果（单位：ng/ μ L)
[0249] 2、经计算，质粒标准分子LY02的磷元素的含量为10. 22%。经过HR-ICP-MS定值 得到质粒标准分子磷元素含量数据如表13所示，稀释倍数为2000,换算得到质粒分子的质 量浓度，如表14所示。
[0250] 表13质粒标准分子LY02的磷元素含量（单位：μ g/L)
[0252] 表14质粒标准分子LY02的质量浓度结果（单位：ng/ μ L)
[0254] 实施例6研制的质粒标准分子LYOl和LY02在实时荧光PCR检测中的应用
[0255] 实验试剂：针对LYOl和LY02质粒标准分子，设计了数十对引物，分别扩增目标序 列中的基因片段，将设计的引物和探针交由宝生物工程（大连）有限公司合成，Master Mix 购自Life technology公司。实验仪器包括：实时焚光定量PCR扩增仪（Life technology) 离心机、恒温水浴锅、培养箱、天平等。
[0256] 质粒标准分子LYOl和LY02在实时荧光PCR检测中的应用：
[0257] 引物（分别使用表15中所示引物）、探针、PCR检测体系
[0258] PCR加样体系：
[0260] 反应条件PCR程序：
[0261] 95 °C 10 分钟；
[0262] 95 °C 15 秒，60 °C 1 分钟，40 个循环。
[0263] 将实施例1制备所得的质粒标准分子LYOl稀释为不同浓度的质粒标准分子 (1. 85 X IO6Copies/ μ L、1. 85 X IO5Copies/ μ L、1. 85 X IO4Copies/ μ L、1. 85 X IO3Copies/ μ L、I. 85 X 102copies/ yL'l.SSXlC^copies/ yL、1.85X10°copies/ yL)，LY02 稀 释为不同浓度的质粒标