了一套单增李斯特菌实时荧光定量PCR检测方法，其所采用的标准 物质是如上所述的质粒标准分子。
[0115] 本发明还提供了一套如上所述的单增李斯特菌的质粒标准分子的制备方法，包括 以下步骤：
[0116] ①人工合成所述单增李斯特菌的特异性序列，所述序列如SEQ ID NO :1和/或3 所示；
[0117] ②将步骤①所得单增李斯特菌的序列克隆至克隆载体上，得到单增李斯特菌的质 粒标准分子。
[0118] 其中步骤①所述的人工合成的方法较佳地为：全基因合成或者PCR引物扩增的方 法获得该序列。
[0119] 本发明所述质粒标准分子构建方法较佳地包括以下步骤：
[0120] ①NCBI (美国国立生物技术信息中心）的Genbank中查询单增李斯特菌的内化素 基因 InlA基因和/或转录激活调节蛋白基因 prfA基因；
[0121] ②对上述序列进行分析，选择合适的序列和合适的酶切位点，并将酶切位点加至 所选择序列的5'端和3'端。
[0122] ③将处理后的序列进行全基因人工合成服务，包括单链Oligo DNA的合成、DNA片 段拼接等工作，并将全长基因克隆至质粒载体中，获得质粒标准分子。
[0123] 所述的质粒载体可以是常规载体，较佳的是克隆载体，更佳的是能够在大肠杆菌 中增殖的克隆载体，所述克隆载体较佳地为：PUC19, pUC18, pUC118, pUC119, pBlueScript II SK或pGEM系列载体，优选地为pUC19克隆载体。
[0124] ④测序验证质粒标准分子的序列。
[0125] ⑤质粒标准分子的实时荧光PCR检测方法验证。
[0126] 所述的实时荧光PCR检测方法验证，是指检测质粒标准分子在进行实时荧光PCR 分析时的特异性和构建标准曲线能力等特性，以鉴定该质粒标准分子作为实时荧光PCR方 法检测单增李斯特菌的标准物质的能力。
[0127] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。
[0128] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0129] 本发明的主要优点在于：
[0130] (1)包含本发明多核苷酸序列的质粒标准分子具有均匀性强，稳定性高的优点，同 时本发明解决了单增李斯特菌实时荧光PCR检测中标准物质缺乏的难题，保证单增李斯特 菌实时荧光PCR方法检测结果的可比性，为单增李斯特菌实时荧光PCR方法检测提供质量 控制；
[0131] (2)使用本发明的质粒标准分子配合本发明的引物对制备的产品，用于实时荧光 PCR检测单增李斯特菌时，特异性强，灵敏度高，线性稳定。
[0132] (3)本发明提供的试剂盒中包含了检测单增李斯特菌的致质粒标准分子（携带内 化素 InlA基因的LYOl质粒标准分子）和/或检测致病型单增李斯特菌的质粒标准分子 (携带转录激活调节蛋白基因 prfA基因的LY02质粒标准分子），
[0133] 下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条 件如 Sambrook 等人，分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和 份数按重量计算。
[0134] 实施例1质粒标准分子的构建
[0135] 实验试剂和实验仪器：
[0136] 质粒大量提取试剂盒（OMEGA)，其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯生化试 剂；实验仪器包括离心机、恒温水浴锅、恒温培养摇床、移液枪等。
[0137] 实验方法包括以下步骤：
[0138] 1、在GenBank中搜索单增李斯特菌的基因内化素 InlA基因序列；
[0139] 2、对上述序列进行分析，选择合适的序列和合适的酶切位点，基因内化素 InlA基 因序列长度为2403bp，两端加上KpnI和BamHI酶切位点；
[0140] 3、将处理后的序列送至宝生物工程（大连）有限公司，由其负责进行全基因人工 合成服务，包括单链01 igo DNA的合成、DNA片段拼接等工作，所得基因内化素 InlA基因 的序列如序列表中SEQ ID N0:3所示，将所得全长基因克隆至质粒载体pUC19(购自TAKARA 公司）中，构建获得包含OMPW基因序列的质粒标准分子LYOl (其序列如序列表中SEQ ID N0:4所示），构建所得质粒标准分子LYOl的质粒图谱如图1所示。
[0141] 4、大量培养含有包含所得质粒标准分子LYOl的重组大肠杆菌，利用质粒大量提 取试剂盒（OMEGA)提取质粒，获得高纯度的质粒标准分子LYOl。经过紫外分光光度计以及 电泳进行纯度分析，之后质粒DNA标准分子置于-20°C保存，抽提质粒的方法包括以下步 骤：
[0142] a、将100~200mL过夜培养的细菌于室温5000 Xg离心10分钟，弃去上清；
[0143] b、加入 12mL Solution I (含有 RNase A)，振荡充分混匀；
[0144] c、加入12mL Solution II，上下颠倒温和混匀，室温放置2分钟以使菌体充分裂 解；
[0145] d、加入16mL Solution III，立即上下充分颠倒混匀数次，直至形成均匀的白色沉 淀；
[0146] e、彡 12000Xg，4°C离心 10 分钟；
[0147] f、吸取20mL上清小心地移至一个干净的HiBind Maxi吸附柱中（置于50mL收集 管中），5000 X g室温离心5分钟；
[0148] g、弃去收集管中的液体，加入IOmL Buffer HB清洗吸附柱，5000Xg室温离心5分 钟；
[0149] h、弃去收集管中的液体，加入15mL DNA Wash Buffer(无水乙醇稀释）清洗吸附 柱；
[0150] i、重复上述清洗步骤；
[0151] j、6000 Xg离心15分钟以干燥吸附柱；
[0152] k、将吸附柱置于一个干净的50mL管中，加入2mL~3mLTE缓冲液，室温放置1~ 2分钟，8000 X g离心2分钟以洗脱DNA，所得DNA溶液即为提取的质粒标准分子溶液，保存 在-20。。。
[0153] 5、测序验证质粒标准分子LYOl
[0154] 将提取的质粒标准分子送至八家测序公司进行序列验证，八家测序公司分别为北 京六合华大基因科技股份有限公司、上海博尚生物技术有限公司、英潍捷基（上海）贸易有 限公司、上海杰李生物技术有限公司、上海美吉生物技术有限公司、上海生工生物技术有限 公司、苏州金唯智生物科技有限公司、宝生物生物工程有限公司。对于质粒DNA标准物质来 说，序列长度与定量有直接关系，8家不同的测序公司进行序列测定是标准物质研制中对于 定值的要求。详见ISO导则35,标准物质定值部分的具体要求。
[0155] 序列考察公式：序列正确率=正确碱基数目/碱基总数
[0156] 测序结果证明，所有参与序列验证的单位得到的序列正确率为100 %，该质粒序列 中的第414位到第2816位为基因内化素 InlA基因。
[0157] 实验结果为：经过序列选择步骤、全基因人工合成步骤以及质粒大量提取等步骤 得到高纯度的质粒标准分子LYOl经测序验证，该质粒标准分子插入片段序列与设计完全 相符。
[0158] 采用上述相同的方法，构建LY02质粒，将所得基因转录激活调节蛋白基因 prfA基 因序列（如序列表中SEQ ID N0:1所示），克隆至质粒载体pUC19中，构建获得包含prfA基 因序列的质粒标准分子LY02(其序列如序列表中SEQ ID N0:2所示），构建所得质粒标准分 子LY02的质粒图谱如图4所示。经测序验证，该质粒标准分子插入片段序列与设计完全相 符。
[0159] 实施例2质粒标准分子LYOl和LY02的均匀性检验
[0160] 均匀性是表征物质中一套或多种特性相关的结构或组成的一致性状态。通过测量 取自不同包装单元（如瓶、包等）或取自同一包装单元不同位置的规定大小的样品，测量结 果落在规定不确定度范围内，则可认为该标准物质对指定的特性量是均匀的。均匀性是标 准物质的基本属性，用于描述标准物质特性的空间分布特征。在标准物质的研制（生产） 过程中必须进行均匀性评估，以证明其具有良好的均匀性。均匀性良好的质粒标准分子，其 量值不会受到分装等因素的影响，各瓶间的量值差异不大，因此保证了检测结果的可靠性。
[0161] 实验试剂TE缓冲液（pH7. 5)。实验仪器Nanodrops ND-2000。
[0162] 实验方法：
[0163] 1、按照《JJG 1006-1994 -级标准物质技术规范》均匀性抽取样品要求，从各质粒 DNA标准物质中随机抽取15瓶。
[0164] 2、对所取每个样品取样3次，每次取样量为1 μ L。每个取样量用紫外分光光度重 复测定3次，取平均值。
[0165] 3、对测定结果用F检验法进行统计，判断均匀性检验结果。具体方法为：抽取m个 样本，在相同条件下测得m组等精度测