一种食品致病菌pcr扩增产物的快速检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及致病菌检测，尤其是设及一种致病菌PCR扩增产物的快速检测方法。
【背景技术】
[0002] 食品是人类赖W生存的根本基础，食品安全则关乎广大人民群众的身体健康和生 命安全，频频爆发的食品安全事件不仅给人民群众的身体健康构成了严重威胁，而且也给 消费者和食品相关产业造成了巨大的经济损失，给社会、经济、政治的稳定和国家形象带来 不利的影响。灵敏高效的食品安全检测技术在保障食品安全、尤其是致病菌导致的食源性 疾病控制中具有至关重要的作用，根据美国农业部经济研究局的统计结果显示，沙口氏菌、 致病性大肠杆菌、弯曲杆菌、副溶血性弧菌、葡萄球菌及毒素、致病性蜡样芽胞杆菌、产气芙 膜梭菌、变形杆菌属、李斯特菌、志贺氏菌等几类重要的细菌会造成巨大的经济损失，而志 贺氏菌具有高度传染性，是引起感染性腹泻的主要致病菌之一;致病性蜡样芽胞杆菌多存 在于蛋白质和碳水化合物丰富的米饭及肉类食品中，可引起腹泻综合征及呕吐综合征。人 们在食用被上述运些细菌污染的食物后，可引起腹泻、恶屯、、呕吐，严重者可致腹痛、出血性 肠炎及尿毒综合征甚至死亡。因此，食品安全性检测与评价逐步受到我国及其他国家的重 视与关注。
[0003] 针对食品微生物污染的现状，各国已经发展和衍生了多种食品微生物检测技术， 目前，主要的几种快速检测技术包括实时巧光PCR法、巧光免疫检测法、基于PCR基础的凝胶 电泳法等，但上述方法均有应用范围的局限性，实时巧光PCR法检测成本高，对致病菌的检 测范围小;基于PCR基础的凝胶电泳法操作繁琐，易引起污染。因此，寻找和建立一种快速、 高效、准确的食品微生物的检测方法十分重要。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种检测速度快、灵敏度和特异性高的食品致 病菌PCR产物的快速检测方法。
[000引本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种食品致病菌PCR扩增产物的 快速检测方法，包括W下步骤:将待测食品致病菌PCR扩增产物中加入50 μΜ的血晶素溶液 后，于37°C反应10 min后形成G-四联体，然后加入ΤΜΒ显色液，在室溫下解育5-10 min直至 溶液颜色变成蓝色，用0.16 Μ的也S化溶液终止后，通过颜色变化确定待测样品中是否含有 食品致病菌，其中所述的待测食品致病菌PCR扩增正向引物或者反向引物的5'端链接有辣 根过氧化酶互补序列，所述的辣根过氧化酶互补序列的基因序列为 AAAAAATTTACCCAACCCGCCCTACCCAAAAAATTTACCCAACCCGCCCTACCC ΑΑΑΑΑ 0
[0006] 所述的待测食品致病菌PCR扩增产物、所述的血晶素溶液、所述的ΤΜΒ显色液与所 述的也S化溶液的体积比为5:1:4:25。
[0007] 所述的ΤΜΒ显色液的配方为8 μL肥阳S缓冲液，4 μL 500mM的KC1溶液，化L也化。
[0008] 所述的待测食品致病菌PCR扩增体系中致病菌DNA模板采用磁珠法提取，具体步 骤如下： (1) 取1 mL待测食品致病菌菌液，10000 r/min离屯、5 min,去上清，沉淀溶于1 mL细菌 裂解液中，振荡15s，70°C水浴12 min，W5000 r/min离屯、，得到1 mL细胞裂解清液； (2) 在ImL细胞裂解清液中加入10化磁性纳米粒子，满旋5s，然后再加入600化吸附缓 冲液混匀，振荡反应15min，磁性分离去上清； (3) 用1血70wt%乙醇溶液清洗MNPs两次，室溫放置30 min，使乙醇挥发完全;再加入50 化洗脱缓冲液TE，混匀后静置10 min，65°C水浴10 min,磁分离，取上清，即为待测食品致 病菌DNA模板溶液，-20°C备用。00260/280=1.8，相对于普通试剂盒的提取纯度提高了 20%左 -6" 〇
[0009] 所述的细菌裂解液的配方为50化1M的Tris-HCl，50化15wt%的SDS溶液，50μΙ 20mg/ml的蛋白酶k，20化0.5Μ的抑=5.0的抓ΤΑ，2化RNA酶，用双蒸水补足至1血;所述的吸 附缓冲液的由80化9wt%的聚乙二醇20000溶液和500化的5Μ的化C1溶液混合而成；所述 的洗脱缓冲液TE的配方成分为lOmM的Tris-肥1，1 mM邸TA，p册.0。
[0010]所述的待测食品致病菌PCR扩增体系为ΙμΜ待ii食品致病菌正反向引物各2.5化， 25 ml MgCb溶液2.5 化，200 μΜ dNTP 化L，1.25 U Taq DNA酶0.化L和2.扣L待测食品致 病菌DNA模版，用双蒸水补足至25 μレ反应条件:95°C预变性4 min;5°C变性30s，55°C退火 45s，72°C延伸1 min，25个循环；最后72°C延伸10 min; 所述的待测食品致病菌为副溶血弧菌、大肠杆菌或者空肠弯曲杆菌。
[0011]与现有技术相比，本发明的优点在于:本发明首次公开了一种食品致病菌PCR扩增 产物的快速检测方法，该方法在PCR扩增反应的反向引物或者正向引物的5'端链接辣根过 氧化酶互补的序列，随着目标条带扩增的进行，辣根过氧化酶序列也被扩增，待扩增结束 后，加入血晶素形成G-四联体，此结构具有辣根过氧化酶的催化活性，然后再加入新鲜配制 的试剂，G-四联体氧化刚加入的试剂，使溶液颜色产生变化，在特定的波长下用酶标仪检 巧。，其检测原理图如图1和图2所示。该检测工作可在5 min内完成并得到检测结果;能够快 速检测致病菌，检测灵敏度达1〇5 C化/mL，实现传统凝胶电泳无法实现的快速实现致病菌的 半定量检测;本发明只需将特异性目标引物进行相应替换，即可实现其他目标物的快速、灵 敏检测;本发明还具有特异性高，稳定性好，应用范围广，成本低廉等优点，易于推广应用。
【附图说明】
[001引图1为本发明食品致病菌PCR扩增产物的快速检ii方法的原理示意图一;其中辣根 过氧化酶互补的序列与PCR扩增反向引物链接； 图2为本发明食品致病菌PCR扩增产物的快速检测方法的原理示意图二;其中辣根过氧 化酶互补的序列与PCR扩增正向引物链接； 图3为实施例1中磁珠法提取的副溶血性弧菌DNA模板的DNA琼脂糖凝胶电泳图；图中 1、1、2、3、4、5分别代表分子量不同的0魁片段，3.4*105,3.4*106,2.8*107，1.1*108,2.2*108 C化/mL副溶血性弧菌的DNA的电泳条带； 图4为实施例1中不同浓度副溶血弧菌DNA模版经过PCR扩增反应之后的琼脂糖凝胶电 泳图；图中M、l、2、3、4、5分别代表分子量不同的DNA片段，提取3.4*105,3.4*106,2.8*10 7， 1. 1*108,2.2*108 C化/血副溶血性弧菌的DNA经PCR扩增后的电泳条带，6代表阴性对照电泳 条带； 图5为实施例1中不同浓度副溶血弧菌DM模版经过PCR扩增反应之后加入血晶素及显 色液后的吸光度图；图中1、2、3、4、5分别代表提取3.4*105,3.4*106,2.8*107，1.1*108,2.2* 108 C化/血副溶血性弧菌的DM经PCR扩增显色后的吸光度图，6代表阴性对照的吸光度图； 图6为实施例2中磁珠法提取的大肠杆菌DNA模板的DNA琼脂糖凝胶电泳图；图中M、l、 2、3、4、5分别代表分子量不同的 DNA 片段，提取1.3*105，1.3*106，1.1*107,4.3*107,8.6*107 C化/mL大肠杆菌的DNA的电泳条带； 图7为实施例2中不同浓度大肠杆菌DNA模版经过PCR扩增反应之后的琼脂糖凝胶电泳 图；图中M、l、2、3、4、5分别代表分子量不同的DNA片段，1.3*105，1.3*106，1.1*107,4.3*107， 8.6*107 C化/mL大肠杆菌的DNA经PCR扩增后的电泳条带，6代表阴性对照电泳条带； 图8为实施例2中不同浓度大肠杆菌DNA模版经过PCR扩增反应之后加入血晶素及显色 液后的吸光度图；图中1、2、3、4、5分别代表 1.3*105，1.3*106，1.1*107,4.3*107,8.6*107 C化/mL大肠杆菌的DNA经PCR扩增后显色后的吸光度图，6代表阴性对照的吸光度图； 图9为实施例3中磁珠法提取的空肠弯曲杆菌DNA模板的DNA琼脂糖凝胶电泳图；图中 1、1、2、3、4、5分别代表分子量不同的0魁片段，提取1.3*105，1.2*106，1.0*107,4.1*107， 8.2*107 C化/mL空肠弯曲杆菌的DNA的电泳条带； 图10为实施例3中不同浓度空肠弯曲杆菌DNA模版经过PCR扩增反应之后的琼脂糖凝胶 电泳图；图中M、1、2、3、4、5分别代表分子量不同的DNA片段，1.3*105,1.2*106,1.0*10 7， 4.1*107，8.2*107 C化/血空肠弯曲杆菌的DNA经PCR扩增后的电泳条带，6代表阴性对照电泳 条带； 图11为实施例3中不同浓度空肠弯曲杆菌DNA模版经过PCR扩增反应之后加入血晶素及 显色液后的吸光度图；图中1、2、3、4、5分别代表1.3*105，1.2*106，1.0*107,4.1*107,8.2* 107 C化/血空肠弯曲杆菌的DNA经PCR扩增后的电泳条带，6代表阴性对照的吸光度图。
【具体实施方式】
[0013] W下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0014] 实施例1 一种副溶血弧菌PCR扩增产物的快速检测方法，具体步骤如下： (1)磁珠法提取副溶血弧菌DNA模板 A.取ImL副溶血弧菌菌液，10000 r/min离屯、5 min,去上清，沉淀溶于1 mL细菌裂解液 中，振荡15s，70°C水浴12 min，W5000 r/min离屯、，得到1 mL细胞裂解清液;其中细菌裂解 液的配方为50化1 Μ的Tris-HCl，50化15wt%的SDS溶液，50化20 mg/ml的蛋白酶k， 20化0.5 Μ的抑=5.0的邸TA，化LRNA酶，用双蒸水补足至1 ιΛ; Β.在1 mL细胞裂解清液中加入10化磁性纳米粒子，满旋5s，然后再加入600化吸附 缓冲液混匀，振荡反应15 min,磁性分离去上清；其中吸附缓冲液的由80化9wt%的聚乙二 醇20000溶液和500化的5 Μ的NaCl溶液混合而成； C.用1血70wt%乙醇溶液清洗MNPs两次，室溫放置30 min,使乙醇挥发完全;再加入50 μ L洗脱缓冲液ΤΕ，混匀后静置10 min，65°C水浴10 min,磁分离，取上清，即为副溶血弧菌 DNA模板溶液，-20°C备用；其中洗脱缓冲液TE的配方成分为lOmM的化is-HCl，1 mM EDTA， 抑8. ο;磁珠法提取的副溶血弧菌DM模板的DM琼脂糖凝胶电泳图如图3所示，说明磁珠法 提取的DNA效果很好，纯度高； (2) PCR扩增:反应体系：lμM副溶血弧菌正反向引物各2.化L，25mMMgCl2溶液2.5μ