利用pH敏感染料的扩增反应产物的检测的制作方法
【专利说明】利用pH敏感染料的扩增反应产物的检测
[0001] 发明背景
[0002] 序列特异的等温和聚合酶链式反应（PCR)核酸扩增技术代表分子诊断学的快速 增长部分，提供快速、灵敏的DNA样品检测。
[0003] 电泳是检测扩增后步骤中的DNA产物的传统方法，其利用劳动密集的手动处理和 仪器。最近，等温扩增的发展已提供了可选的检测方法，例如，具有嵌入或镁敏感的荧光基 团的双链 DNA (dsDNA)的荧光检测（Notomi，et al·，Nucleic Acids Res. ,28 :E63 (2000); Tomita, et al. , Nat. Protoc, 3 :877-82 (2008) ；Goto,et al.,BioTechniques, 46 ： 167-72,（2009));通过焦磷酸盐转化的生物发光（Gandelman, et al.，PLoS One, 5 : el4155(2010);或沉淀的焦磷酸镁的池度检测（Mori et al.，Biochem.Biophys.Res.
[0004] Commun.，289 :150-4(2001))。然而，这些可视方法通常需要长的温育时间（>60分 钟），需要专门的检测仪器，或针对在实验室外强大的检测，变化太微细。实时PCR设备和化 学的进展已允许在PCR反应期间同时监测许多样品。检测原理通常基于利用具有嵌入染料 的dsDNA的荧光检测或利用需要昂贵仪器的序列特异的荧光探针。可选地，已发展了用于 检测在聚合酶依赖性扩增过程中释放的氢离子的仪器。这些氢离子的检测已利用复杂的电 子检测和微流体装置实现，例如如美国专利号7, 888, 015中所示，用于高通量下一代测序 (Ion Torrent?Sequencing, Life Technologies, Grand Island, NY)〇
[0005] 床边和现场诊断学需要快速和简单的测试，理想地，在小于30分钟里检测靶核酸 而无需复杂和昂贵的设备。
[0006] 概述
[0007] 在本发明的实施方式中，提供这样的制剂（制备物，preparation)，其包括在含有 小于ImM Tris弱缓冲剂或等价物或没有缓冲剂的配制物（formulation)中的pH敏感染料、 DNA 聚合酶、dNTPs。
[0008] 一方面，制剂包括一种或多种引物；和模板DNA。另一方面，pH敏感染料是视觉上 可检测的彩色染料或荧光染料。
[0009] 在本发明的一个实施方式中，提供检测核酸扩增的方法，其包括：提供含有模板 DNA的扩增反应混合物；在弱缓冲或非缓冲溶液中的DNA聚合酶和pH敏感染料；和检测由 靶DNA扩增产生的染料的光谱性质变化。
[0010] 一方面，核酸扩增是等温扩增或PCR。
[0011] 另一方面，等温核酸扩增选自环介导的等温扩增（LAMP)、解旋酶置换扩增（HDA)、 链置换扩增（SDA)、重组酶聚合酶扩增（RPA)和缺口酶扩增反应（NEAR)。
[0012] 一方面，pH敏感染料是可溶性的，另一方面，可溶性的染料是可见光中可检测的彩 色染料。合适染料的实例是甲酚红、酚红、间甲酚紫、溴甲酚紫、中性红、萘酚酞、百里酚蓝、 萘酚酞。
[0013] 另一方面，pH敏感染料是荧光染料，例如，2'，7' -双-(2-羧乙基）-5-(和-6)-羧 基焚光素或羧基半萘罗丹明焚光剂（seminaphthorhoda fluor)。
[0014] 另一方面，弱缓冲溶液含有小于ImM Tris缓冲剂或等价的缓冲剂。
[0015] 在方法的另一个方面，检测扩增依赖于比较扩增发生之前和之后染料的光谱或荧 光性质的变化。
[0016] 在本发明的一个实施方式中，提供监测靶序列一一如果存在于样品中一一的核酸 扩增的方法，其中在存在靶序列的情况下在扩增进行超过阈值数量的循环时测定PH的变 化，通过将PH敏感彩色或荧光染料加入到反应混合物实现监测；和确定扩增之前与扩增已 发生时相比的颜色变化。
[0017] 附图简述
[0018] 专利或申请文件含有至少一个彩色制作的图。具有彩图的该专利或专利申请公开 的复印件将在请求和支付必需的费用之后由专利局提供。
[0019] 图IA和IB显示利用多种指示剂染料完成的扩增反应的可见的颜色变化检测。这 里，LAMP用于在pH 9下的低缓冲溶液中扩增λ噬菌体DNA靶序列，以便在扩增结束时，pH 降低，颜色变化发生。
[0020] 图IA显示在反应开始时在存在50 μ M或100 μ M的酚红、甲酚红、中性红和间甲 酚紫的情况下样品的颜色。
[0021] 图 IB 显不当 Bst 2. 0 (New England Biolabs, Ipswich, MA) DNA 聚合酶被包括在反 应混合物中而不是当它被省略时，响应由扩增引起的渐降的pH，在65°C在30分钟LAMP反 应之后样品的颜色。在存在酚红和甲酚红的情况下，样品从红色变成黄色；利用中性红从无 色变成红色；用间甲酚紫从紫色变成黄色。
[0022] 图2A和2B显示扩增反应之前和之后染料颜色的比较。利用LAMP在如所指示的 最初的pH 10或pH 7. 5的低缓冲溶液中扩增λ噬菌体DNA靶，以便颜色变化在扩增反应 结束时发生。
[0023] 图2Α显示在反应开始时的样品颜色。这里使用的染料是在pH 10下的较高碱度 的指示剂（百里酚蓝、萘酚酞、酚酞），或在PH 7.5下的更中性的指示剂（溴甲酚紫），全部 以50 μ M或100 μ M包括，如所显示的。
[0024] 图2Β显示当Bst 2. ODNA聚合酶被包括在反应混合物中而不是当它被省略时，响 应由扩增引起的渐降的pH，在65 °C在60分钟LAMP反应之后样品的颜色。含有Bst 2.0 的样品在存在百里酚蓝的情况下从蓝色变成黄色；在存在萘酚酞的情况下从蓝色变成 无色（50uM)或浅蓝色（IOOuM);在存在酚酞的情况下从粉色变成无色（50uM)或浅粉色 (IOOuM);在存在溴甲酚紫的情况下从紫色变成黄色。
[0025] 图3A-C显示扩增反应中的颜色变化检测对靶DNA的扩增是特异的。这里两种不同 的DNAs在扩增时显示反应相似。LAMP反应在具有针对秀丽隐杆线虫（C.elegans) Iec-IO 或人BRCAl序列靶的引物的低缓冲剂反应溶液中进行，如所指示的。
[0026] 使含有Bst 2. ODNA聚合酶和靶基因组DNA (+Temp)或非模板对照（NTC)和 IOOyM的指示剂染料（酚红、甲酚红、中性红或间甲酚紫）的反应在65°C温育（a)0分钟、 (b) 15分钟或（c) 60分钟。
[0027] 图3A显示特定指示剂的所有管在时间=0分钟以相同颜色开始。
[0028] 图3B显示只有含有模板DNA的样品在扩增开始之后15分钟改变颜色，指示靶DNA 的阳性扩增。
[0029] 图3C显示扩增的含有模板DNA的样品的颜色变化已在扩增开始之后60分钟加 剧。一些NTC由于非特异扩增而显示颜色变化的中间水平，虽然暂时与阳性（靶）扩增清 楚地区分。
[0030] 图4A-C显示在利用四种pH敏感染料的扩增期间响应模板量随着反应时间的颜色 变化敏感性。
[0031] LAMP反应利用模板DNA (HeLa)的连续10倍滴定（lOOng-O. Ing或0.0 lng)在具有 针对人CFTR序列的引物的低缓冲剂反应溶液中进行，如所指示的。
[0032] 图4A显示在时间=0分钟时指示剂染料（每种100 μ M)的颜色。
[0033] 图4Β显示在时间=利用酚红和中性红染料的IOOng-O. Ing靶DNA，和针对甲酚红 和间甲酚紫染料的IOOng-O. Olng DNA扩增之后15分钟的颜色变化。
[0034] 图4C显示在时间=30分钟时与图4Α和4Β中相同的反应，其中针对所有染料所 有模板量观察完全的颜色变化，而所有非模板对照保持最初的颜色。
[0035] 图5显示利用低缓冲剂反应中100 μ M酚红的PCR扩增反应的检测。只有含有 DNA模板的一式三份的反应（标记的1、2和3)颜色从粉色变成黄色，而无 DNA模板的反应 (4、5和6)保持粉色。
[0036] 图6显示通过利用含有100 μ M酚红的PCR反应，菌落中特异质粒DNA的鉴定。 PCR之后，具有来自三个含有靶质粒的菌落的细菌的阳性样品（1-3)颜色从粉色变成黄色。 三个具有来自含有无关质粒的菌落的细菌的阴性对照（a-c)不这样。这与具有质粒DNA的 阳性（+)反应和只具有水的阴性对照（-)的结果匹配，并显示颜色变化检测针对特定质粒 的存在筛选菌落的适用性。
[0037] 图7A和7B显示在存在和缺少Bst 2. 0聚合酶的情况下利用100 μ M可见pH指 示剂，针对人DNA和BRCAl基因引物的SDA反应的检测。颜色变化在含有Bst 2. 0的样品 中观察到，在缺少Bst 2.0的样品中没有观察到颜