色变化。
[0038] 图7A显示在存在或缺少Bst 2. 0的情况下在反应开始时反应的颜色。
[0039] 图7B显示在存在或缺少Bst 2.0的情况下在65°C温育1小时之后反应的颜色。 颜色变化只发生在存在聚合酶的情况下，提示扩增的检测。
[0040] 图8A-C显示利用荧光pH指示剂的实时测量的LAMP反应的检测。数据被绘制为 减去的RFU，其中将背景值从最终的RFU (图8A和8B)或最初的RFU (图8C)减去以产生基 线（ORFU)。在没有DNA聚合酶的情况下，几乎没有观察到荧光变化（虚线），显示检测对扩 增是特异的并且PH漂移在等温条件下是最小的。
[0041] 图8A显示在存在Bst 2. ODNA聚合酶的情况下对应于DNA扩增反应，针对 BCECF-AM的荧光的显著下降（CFX96?荧光计（Bio-Rad, Hercules CA)FAM波道中测量的）。
[0042] 图8B显示响应DNA扩增，针对高pH形式的SNARF-1'K〕（Life Technologies, Grand Island, NY) (R0X 波道）的焚光下降。
[0043] 图8C显示响应DNA扩增，针对低pH形式的SNARF-I (HEX波道）的荧光的增加。
[0044] 图9A-C显示LAMP反应中pH变化的荧光检测的灵敏度。反应含有针对人CFTR的 引物和不同量的模板HeLa DNA，如所指示的。观察pH变化是以模板浓度依赖性方式，其中 荧光变化需要的时间与反应中存在的模板DNA的量关联。较高的模板量产生更迅速的pH 变化，并因此荧光变化，较低的模板量导致较低的pH变化，而NTC在最初的pH和荧光值下 保持稳定。
[0045] 图9A显示DNA扩增期间对应于针对BCECF-AM的pH下降的荧光下降。
[0046] 图9B显示DNA扩增期间对应于针对SNARF-I (高pH)的pH下降的荧光下降。
[0047] 图9C显示DNA扩增期间低pH形式的SNARF-I的荧光增加。
[0048] 图IOA和IOB显示利用SNARF-I扩增不同大小靶DNA的PCR反应的检测。扩增具 有不同大小（114bp、308bp、1278bp)的三个片段。反应中模板DNA的存在导致PCR期间荧 光读数的显著变化（超过背景变化>5000RFU)。信号下降的水平与扩增子大小成比例，针对 IHbp具有~5000RFU减少，针对300bp为6000RFU，针对1278bp扩增子为8000RFU。所有 扩增子都导致针对~20个循环的背景校正的荧光下降的阈值时间。
[0049] 图IOA显示PCR循环中记录的原状的、未校正的RFU。
[0050] 图IOB显示在减去来自无 Taq DNA聚合酶的管的信号之后PCR循环期间的净RFU 变化以校正由于PCR反应的热循环而引起的背景pH和荧光下降。
[0051] 实施方式的描述
[0052] DNA合成期间的三磷酸核苷掺入事件产生在DNA聚合酶催化的反应期间的焦磷酸 盐基团以及氢离子。
[0053] 在没有缓冲条件的情况下，质子在DNA扩增反应中累积，以至于随着渐增的DNA扩 增，溶液变得愈加酸性。
[0054] 虽然最初关注pH指示剂染料一一其是大量的有机分子一一可干扰扩增反应，或扩 增期间质子浓度的增加不足以允许PH指示剂中颜色或荧光的可检测变化，但是显示这些 分子可用于监测DNA扩增。观察到LAMP反应中pH变化高达4pH单位，不论溶液的缓冲能 力，和来自dNTPs、核酸、酶和从储存溶液延续的缓冲剂的缓冲贡献。监测扩增反应的化学 和荧光染料的效用得到一系列不意欲被限制的实例的支持。荧光染料和包括优选地眼可看 见的PH指示剂染料的化学染料在：各个时间点；不同浓度的染料和DNA靶；不同类型靶DNA 和利用聚合酶和核苷酸的任何类型的扩增程序--如，例如，SDA、LAMP和定性和定量分析 的PCR-一的扩增产物形成的检测中是有效的。显著地，扩增终点的检测可明确地实现。
[0055] 本发明的实施方式提供组合物和方法，其单独或一起利用充当检测DNA扩增的手 段的宽范围的PH敏感的可见的或荧光染料，以低成本和强大效率迅速和可靠地检测扩增 产物的形成和任选地其量。由于聚合酶通常在5-10的pH下起作用，所以染料的选择反映该 范围内的变化。对于可见的染料，颜色变化在不同的PH被确定，而对于荧光染料，当pH减少 时荧光的增加或减少可被检测，取决于众所周知的荧光染料的性质（参见例如，BCECF-AM 对 SNARF-1)。
[0056] 利用指示剂染料，在缺少反应缓冲剂和在存在一些残留缓冲剂（例如，达，至少约 ImM缓冲剂，例如150 μ MTris)--如当从酶储存缓冲液延续时可出现--的情况下，扩增 反应的pH可被可靠地测量。在一个实施方式中，利用标准条件在缺少反应缓冲剂或在存在 残留缓冲剂（150 μ MTris)的情况下进行PCR反应，获得相似的结果。
[0057] 利用对至少pH 5-10的pH范围耐受的链置换聚合酶，在具有〈1 mM缓冲剂的溶 液中进行LAMP。通过在碱性条件（pH 8-10)在存在中性pH范围转变指示剂的情况下启动 反应，观察到最初的高pH颜色（参见例如，表1)。当扩增进行时，溶液pH在少至10分钟里 基本上下降到第二酸性pH (pH5-7)，导致可检测的颜色变化。该颜色差异容易用眼看见。
[0058] 存在具有不同颜色的宽范围的pH颜色指示剂，其任何一种都适合用于本实施方 式（例如紫色至黄色、红色至黄色、黄色至红色）。本文提供8种不同pH敏感染料的实例， 其在不同pH改变颜色。这些实例不意欲被限制。
[0059] 指示剂染料的光谱性质的变化的检测可利用例如，操作者的眼、荧光计或分光光 度计，由它们的光化学性质而实现。术语〃检测〃可与术语〃监测〃可互换地使用。
[0060] 合适的可见的染料包括：中性红，当pH高于8时其具有净黄色，当pH小于6. 8时 是红色；酷红，当pH高于8时其具有红色，当pH小于6. 4时是黄色；甲酯红，当pH高于8. 8 时其具有微红-紫色，当pH小于7. 2时是黄色；百里酚蓝，当pH高于9. 6时其具有蓝色，当 pH小于8. 0时是黄色；酚酞，当pH高于10时其具有深紫红色，当pH小于8. 3时无色；和萘 酚酞，当pH高于8. 7时其具有浅绿色，当pH小于7. 3是淡微红色。用于本文的染料的这些 性质被总结在表1中。
[0061]
[0062]
[0063] pH指示剂的其它实例包括：甲基黄、甲基橙、溴酚蓝、萘基红、溴甲酚绿、甲基红、 石蕊素、尼罗蓝、百里酚酞、茜素黄、水杨酰基黄、硝基胺。这些指示剂可在传统的DNA聚合 酶耐受范围外转变，但是扩增检测的原理可用于使用适合期望PH范围的指示剂的可选检 测方法。
[0064] 需要检测装置的一类染料是荧光染料。如同上面提到的可见染料，pH敏感荧光染 料在不同PH下具有不同水平的荧光发射或最大发射波长转换。亮度变化和最大吸收移位 (shift)均可利用装备有适当过滤装置的系统容易地检测。
[0065] 用于本发明实施方式的荧光染料包括5-(和-6)羧基SNARF-1，其特征是基于pH 的荧光移位。在高口11(?!19)下，5嫩1^-1最大吸光度/发射在4_ 575腹/^111_65〇11111。当 pH降低时，这些值显著地蓝移（blue-shift)到Amax 525/Emmax 590。该荧光移位允许两种 状态的染料同时监测，其中一个荧光波道匹配高PH形式（显示荧光随着扩增减少，图5)，另 一个波道匹配低PH形式（荧光增加）。我们测量了在pH从pH 10下降到pH 6校准溶液 之后高pH形式荧光90%丧失（在CFX96仪器的ROX波道中测量或荧光的200%增加 （HEX 波道）。与SNARF-I相关的其它合适的荧光染料已被发展用于监测pH变化，包括SNARF-4F 和 SNARF_5F、SNAFRs、SNAFL、5_(和 _6)_ 幾基蔡基焚光素（carboxynaphthofluorescein)、 6-J0E、Oregon Green ? (Life Technologies, Grand Island, NY)。其它的焚光 pH 指不 剂包括2'，7'-双-(2-羧乙基）-5-(和-6)-羧基荧光素、乙酰氧甲基酯（BCECF-AM) (LifeTechnologies, Grand Island, NY)，其在 pH 9 下具有 Amax 500nm/Emmax535nm 的吸光度 /发射分布。它还具有的特征是当PH下降时光谱蓝移，但是低pH形式在激发中不太有效， 并且有效的读出限于来自高pH形式的荧光减少。针对BCECF-AM(CFX96的FAM波道）测量 从pH 10到pH 6荧光减少大约80%。BCECF源自荧光素，许多与荧光素相关的染料显示对 pH变化的相似敏感性。
[0066] 包括上面提到的那些的可见和荧光染料可被化学修饰以响应pH变化而具有改变 的色度性质。这些修饰可产生这样的染料，其在更窄的PH范围更亮或改变颜色，因此允许 更