利用实时荧光定量pcr技术获取多糖类中药对家禽免疫功能增强作用中间信息的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及药效检测技术领域，具体为一种利用实时巧光定量PCR技术获取多糖 类中药对家禽免疫功能增强作用中间信息的方法。
【背景技术】
[0002] 目前，随着养殖业的规模化发展，禽病的发生变得越来越复杂，靠疫苗和药物已经 不能阻止疫病的发生，如何增强家禽机体自身的免疫功能变的越来越重要。中药免疫增强 剂是近年来研究与应用得比较多的中药免疫制剂，中草药主要通过对机体免疫器官发育的 促进效果，增加非特异性免疫和特异性免疫等，从而增强机体的免疫能力。中药的免疫增强 作用与其活性物质有关，多糖是许多中药的主要免疫活性物质，中草药多糖是增强机体免 疫的物质基础，对促进和恢复机体免疫机能的效果最为明显。目前对于中草药多糖免疫增 强效果的检测，主要依靠血清学试验检测抗体、动物回归试验检测各项生活指标，如测定中 性粒细胞的吞隧功能、T淋己细胞转化率等。运些方法繁琐费时、灵敏度不高、工作量大、效 率低。
[0003] 实时巧光定量PCR(如anti化tive Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中，W巧 光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对 待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。具有快速高效、灵敏度高、特异性强等特 点。经过对现有技术的文献检索，未发现有利用实时巧光定量PCR来获取多糖类中药对家禽 免疫增强作用中间信息的方法，因此建立巧光实时定量PCR检测多糖类中药对家禽免疫增 强作用的方法十分必要。
【发明内容】
[0004] 本发明所解决的技术问题在于提供利用实时巧光定量PCR技术获取多糖类中药对 家禽免疫功能增强作用中间信息的方法，从而解决上述【背景技术】中的问题。
[0005] 本发明所解决的技术问题采用W下技术方案来实现：
[0006] 利用实时巧光定量PCR技术获取多糖类中药对家禽免疫功能增强作用中间信息的 方法，包括如下步骤：
[0007] (1)提取动物血液样品的基因组RNA;
[000引 （2)将步骤(1)所得的基因组RNA反转录为cDNA;
[0009] (3)在巧光定量PCR反应体系中分别加入β-actin引物、化-巧I物（即白介素-2引 物）、步骤(2)得到的cDNAW及巧光染料反应液，混匀，进行PCR扩增；
[0010] (4)PCR扩增结束后，根据巧光实时定量PCR专用仪对结果进行分析，根据IL-巧口 β- actin基因的Ct值，通过相对Ct法即2-A AGt法，来计算IL-2基因 mRNA的相对表达量，所述IL-2 基因 mRNA的相对表达量即为多糖类中药对动物免疫功能增强效果中间信息。
[0011] 本领域技术人员应该知晓，化-2基因 mRNA的相对表达量，无法直接得出动物的健 康状况。但是IL-2基因 mRNA的相对表达量却在一定程度上反映了动物免疫系统的活度，对 于多糖类中药是否对家禽免疫功能起到增强效果起到一定的指示作用。因此，通过实时巧 光定量PCR技术来检测IL-2基因 mRNA的相对表达量，可W获取多糖类中药对家禽免疫功能 增强作用的中间信息。
[0012] 综上所述，本发明直接目的并不是获得诊断结果或健康状况，而只是对脱离动物 体的血液样品进行处理或检测，W获取作为中间结果的信息和方法。获取的中间信息能作 为反映多糖类中药是否对家禽免疫功能具有增强作用及作用大小的辅助性手段。
[0013] 本发明中，作为一种优选的技术方案，所述步骤(1)中的动物血液样品是指动物饲 喂多糖类中药后获取的离体血液样品。
[0014] 本发明中，作为一种进一步优选的技术方案，所述步骤（1)中的动物血液样品是指 鸡饲喂多糖类中药后的获取的离体血液样品。
[0015] 本发明中，作为一种进一步优选的技术方案，所述多糖类中药包括黄巧多糖、香茹 多糖和构杞多糖中的一种或几种。
[0016] 本发明中，作为一种优选的技术方案，所述步骤(3)中，β-actin引物包括
[0017] β-actin 引物1:5 ' -GAGACCTTCAACAGCCCAGC-3 ' 和 [001 引 β-actin引物2:5' -CTCCAGAGTCCAGCACGATACC-3'。
[0019] 本发明中，作为一种优选的技术方案，所述步骤(3)中，比-2引物包括
[0020] 比-2 引物 1:5 ' -GTGGATCCTCCGAGTTCAAT-3 ' 和
[0021] 比-2引物2:5'-AACCTTCCTGATGGCTGAATGA-3'。烙解曲线显示，引物特异性良好，见 图1。
[0022] 本发明中，作为一种优选的技术方案，所述步骤(3)中，所述巧光定量PCR反应体系 中β-actin引物、比-巧I物的浓度均为0.1~0.5皿ol/L;PCR扩增时变性溫度为94~95°C，反 应时间为Imin;退火溫度为58~ere,反应时间为Imin;循环数为35~45。
[0023] 本发明中，作为一种进一步优选的技术方案，所述巧光定量PCR反应体系中β- actin引物、化-巧I物的浓度均为0.2ymol/L;PCR扩增时变性溫度为95°C，反应时间为Imin; 退火溫度为60°C，反应时间为Imin;循环数为40。
[0024] 由于采用了 W上技术方案，本发明具有W下有益效果：
[0025] 本发明提供的巧光实时定量PCR检测方法操作简单，具有较高的灵敏度、良好的特 异性，对获取多糖类中药对动物体的免疫增强作用的中间信息具有广泛的适用性，辅助判 断多糖类中药对动物体的免疫增强效果。
[0026] 本发明提供的检测方法可W通过获取的中间信息对多糖类中药对动物的免疫功 能增强作用进行辅助性的相对定量，可W比较不同中草药免疫功能增强作用的大小，从而 筛选效果良好的中草药应用于临床。
[0027] 本发明提供的检测方法反应条件溫和，扩增快速高效，化左右即可完成，不需要电 泳，与普通PCR相比更快速、灵敏，而且没有污染。
【附图说明】
[0028] 图1为实时巧光定量PCR反应中IL-2基因引物的烙解曲线。
[0029] 图2为饲喂黄巧多糖后，实时巧光定量PCR检测鸡IL-2基因相对于对照表达量的变 化倍数。
[0030] 图3为饲喂香茹多糖后，实时巧光定量PCR检测鸡IL-2基因相对于对照表达量的变 化倍数。
[0031] 图4为饲喂构杞多糖后，实时巧光定量PCR检测鸡IL-2基因相对于对照表达量的变 化倍数。
【具体实施方式】
[0032] 为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结 合具体实施例，进一步阐述本发明。
[0033] 本实施例W如下的步骤为前提进行。
[0034] (1)提取动物血液样品的基因组RNA，所述动物血液样品是指鸡饲喂多糖类中药后 的获取的离体血液样品，而多糖类中药则采用了黄巧多糖、香茹多糖和构杞多糖中的一种；
[0035] (2)将步骤(1)所得的基因组RNA反转录为cDNA;
[0036] (3)在巧光定量PCR反应体系中分别加入β-actin引物、化-巧I物（即白介素-2引 物）、步骤(2)得到的cDNA W及巧光染料反应液，混匀，进行PCR扩增，其中，β-actin引物包括 β-actin引 物 l:5'-GAGACCTTCAACAGCCCAGC-3'和β-actin引 物 2:5'- CTCCAGAGTCCAGCACGATACC-3 '，IL-2 引物包括化-2 引物1:5 ' -GTGGATCCTCCGAGTTCAAT-3 ' 和 比-2引物2:5 ' -AACCTTCCTGATGGCTGAATGA-3 '，所述巧光定量PCR反应体系中β-actin引物、 比-2引物的浓度均为0.1~0.5皿ol/MPCR扩增时变性溫度为94~95°C，反应时间为Imin; 退火溫度为58~ere,反应时间为Imin;循环数为35~45;
[0037] (4)PCR扩增结束后，根据巧光实时定量PCR专用仪对结果进行分析，根据IL-2基因 和β-actin的Ct值，通过相对Ct法即2-A AGt法，来计算IL-2基因 mRNA的相对表达量，所述IL-2 基因 mRNA的相对表达量即为多糖类中药对动物免疫功能增强效果中间信息。
[0038] 为了证明本发明的效果，下述实施例进行了对比试验。
[0039] 下述实施例中使用的实验材料、试剂及引物：
[0040] TRI pure LS Reagent购于Invihogen公司；SYBR green real-time PCR mix购 于Toyobo公司；Reverse Transcription system贝勾自Promega公司。
[0041 ] 根据GenBank上公布的鸡化-2基因序列用Primer 5软件设计用于Real-time PCR 反应的引物，W持家基因 β-actin作内参，具体序列如下：
[0042] β-actin 引物1:5 ' -GAGACCTTCAACAGCCCAGC-3 '
[0043] β-actin 引物2:5 ' -CTCCAGAGTCCAGCACGATACC-3 '
[0044] IL-2 引物1:5 ' -GTGGATCCTCCGAGTTCAAT-3 '
[0045] IL-2 引物2:5 ' -AACCTTCCTGATGGCTGAATGA-3 '
[0046] 实施例一
[0047] 利用实时巧光定量PCR技术获取多糖类中药对家禽免疫功能增强作用中间信息的 方法，具体步骤为：
[0048] 1)取20只非免疫健康成年鸡，随机分为两组。实验组将黄巧多糖%剂量饲喂， 连续7天，对照组W生理盐水代替。在停药的第1(1、5(1、10(1、15(1、20(1、25(1、30(1分别屯、脏采取 抗凝血5ιΛ;
[0049] 2)利用TRI pure LS Reagent试剂盒提取血液样品的基因组RNA;
[(Κ)加]3)按常规方法用反转录试剂盒Reverse化anscription System将提取的全血基 因组RNA反转录为cDNA;
[0051] 4)用T0Y0B0公司的SYBO膨Green Realtime PCR Master Mix(code No.QPK- 201)进行Real-time PCR，仪器为Applied Biosystems 7500Rea