一种提高野生稻与栽培稻远缘杂交胚挽救育种效率的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种野生稻与栽培稻远缘杂交育种的方法，特别是一种野生稻与栽培 稻杂交后，提高胚挽育种效率的方法，属于生物学技术育种领域。
【背景技术】
[0002] 野生稻由于长期生长在各种逆境中通常具有许多优良遗传特性，是改良栽培稻提 高产量及其抗病虫害、抗干旱、抗寒冷、改善营养品种的优良遗传资源。一般通过远缘杂交 技术，把野生稻的优良遗传特性整合到栽培稻中，从而用于科学研宄及新品种的创制。
[0003] 但野生稻基因组与栽培稻基因组差异较大，A基因组的栽培稻与BB，CC，BBCC， CCDD，EE，FF，GG，HHKK，HHJJ等9个基因组的野生稻种间杂交后，往往不能正常结实，难以 获得杂交种子，即使获得杂交种子，种子也中途夭折，难以发芽成苗。要使杂交组合获得成 功，需要通过胚挽救途径获得杂种后代。杂种胚挽救培养技术作为组织培养的一个重要领 域已有近百年的历史，杂交、胚珠和杂交幼胚的离体培养，是目前克服受精后发育障碍的有 效方法，在植物育种工作中发挥着极为重要的作用。
[0004] 现有的野栽远缘杂交种胚挽救技术虽有报道，如，迟全勃等，2005年报道的《通 过胚胎拯救将野生稻耐旱特性转移到栽培稻进行远缘杂交初探》；中国专利"提高栽培稻 与不同基因组型野生稻杂交幼胚成苗率的方法"（专利号ZL2006101293081，授权公告号 CN100566557,公开日2008年05月14日）；中国专利"一种胚挽救和离体诱导相结合构建 异源多倍体水稻的方法"（专利申请号201210449736. 8,公开号CN103155854A，公开日2013 年06月19日）。相关报道的胚挽救技术成苗率（31% -75% )相对传统方法（5 % -50% ) 有所提高，并将胚挽救技术与其他技术结合。但培育技术复杂、培养周期长。
[0005] 所以，为了能最大限度的获得野生稻优良遗传特性，避免远缘杂种胚早衰，使大量 远缘杂交胚继续发育成正常种子，有效缩短野栽杂交后代的培育周期和提高杂种成活率， 尽快进入选育程序，整个野栽远缘杂交胚挽救技术需要许多改进的地方。
【发明内容】
[0006] 本发明目的是为解决栽培稻与野生稻远缘杂交过程中，杂交种不结实及胚挽救过 程中效率低的问题，提供一种能快速有效获得大量野栽远缘杂交种苗的新方法。
[0007] 本发明的技术方案是：
[0008]-种提高野生稻与栽培稻远缘杂交胚挽救育种效率的方法，包括以下步骤：
[0009] (1)幼胚消毒处理
[0010] 野生稻与栽培稻授粉后9-11天，取杂交后的种子剥去颖壳后，将种子用体积分数 为65%酒精处理30秒，再用质量分数为0. 2%的升汞溶液消毒处理10分钟，然后用无菌水 清洗6-7次，之后把种子放在灭菌吸水纸上于超净台上风干；
[0011] (2)幼胚接种培养
[0012] 在超净台上，把种子上的胚乳刮除，保留完整的幼胚，把幼胚接种于装有胚培养 基的透明玻璃培养瓶中，将所述培养瓶置于温度为25°C、空气相对湿度为70%、光照强 度为4000LX的光照恒温培养箱中培养，每天光照时间为12小时；所述胚培养基为：改 良MS+琼脂粉8g/L+蔗糖10g/L，pH5.8-6.0,所述改良MS的配方由以下大量元素、微量 元素、铁盐和有机成分组成：大量元素为：KNO 31266mg/L，NH4NO31100mg/L，KH2PO 4170mg/ L，MgSO4 ?7H2O 37〇mg/L，CaCl2 ? 2H2O 440mg/L，微量元素为：KI 0? 83mg/L，H3BO36. 2mg/ L，MnSO4 ? 4H2011. 2mg/L，ZnSO4 ? 7H20 8. 6mg/L，Na2MoO4 ? 2H20 0? 25mg/L，铁盐为： Na2 ? EDTA37. 3mg/L，FeSO4 ? 7H20 27. 8mg/L，有机成分为：肌醇 100mg/L，甘氨酸 2mg/L ;
[0013] (3)组培苗炼苗
[0014] 待幼胚形成三叶期的生根小苗后，从培养瓶中取出小苗用自来水冲洗去除琼脂， 放到试管中，加入自来水，自来水淹没小苗根部，进行炼苗处理，所述炼苗处理是：试管口用 透明保鲜膜封住，放入温度为25°C、空气相对湿度为70 %、光照强度为4000Lx的培养室中 培养，每天光照时间为12小时，同时从炼苗处理的第一天至第五天，每天用大头针在封口 的保鲜膜膜上刺出10-15个小孔，第六天将小苗移栽到盛有土壤的培养钵中，在温室或大 棚中按常规温室水稻栽培进行管理。
[0015] 所述野生稻为景洪普通野生稻（OryzarufipogonGriff.)，所述栽培稻为粳稻 02428。
[0016] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0017] 1、幼胚酒精消毒处理浓度和时间进行上不同于现有的方法。本发明缩短了酒精消 毒时间和降低了酒精浓度，这样便于保护幼胚不受伤害，为提高杂交种苗成活率奠定了基 础。
[0018] 2、对培养基配方的改进。本发明通过大量试验，所使用的改良MS，主要降低了现有 MS培养基中的KN03、NH4N03、KH2P0jPMnSO4.4H20 浓度，同时不加CuSO4 .SH2CKCoCI2 .6H20、 烟酸、盐酸吡哆醇（维生素B6)和盐酸硫胺素（维生素B1),更适宜幼胚的营养生长，并且由 蔗糖适当提供一些C源，后期主要靠其自身光合作用提供C源能量，而又避免传统的MS培 养基的营养物质浓度过高使苗徒长或者污染严重。
[0019] 3、本发明在炼苗技术进行了创新。植株炼苗时，连续5天每天用大头针在封口膜 上刺出10-15个小孔，促使幼苗逐步适应外界环境，从而大大提高了幼苗的成活率，其操作 方便，效果好。
[0020] 综上所述，本发明简化了胚挽救的操作，通过幼胚消毒处理、培养基和炼苗技术的 改进及适宜的培养条件、各步骤的协同作用，整个培育时间仅需30天，大大缩短了培育周 期；同时大幅度地提高了成苗率，使成苗率达到94%，产生了显著的效果，提高了野生稻与 栽培稻远缘杂交胚挽救育种效率。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合景洪普通野生稻（OryzarufipogonGriff.)与粳稻02428的种间远缘 杂交具体实施实例，进一步阐述本发明的方法。各实施例中无特殊说明为常规方法。
[0022] 景洪普通野生稻（OryzarufipogonGriff.)直接来源和原始来源于中国云南省， 原始来源时间和直接来源时间均为2006年4月（采集方式）。粳稻02428为市售。
[0023] (1)幼胚消毒处理
[0024] 在景洪普通野生稻与粳稻02428杂交授粉10天后，从母本粳稻02428上将杂交小 穗取下，共获得50粒种子。立即带回实验室，剥去颖壳经过30秒体积分数为65%酒精处 理，接着将种子放入质量分数为〇. 2%的升汞消毒处理10分钟，然后用无菌水清洗6次，之 后把种子放在灭菌吸水纸上于超净台上风干。
[0025] (2)幼胚接种培养
[0026] 在超净台上，用镊子夹住种子，用手术刀片把50粒种子上的胚乳逐渐刮除，保留 完整的幼胚，把幼胚接种于装有胚培养基的高为10. 5cm，直径为6. 5cm的透明玻璃培养瓶 中，每1瓶放置1粒种子，置于温度为25°C、空气相对湿度为70%、光照强度为4000Lx的光 照恒温培养箱中培养，每天光照时间为12小时。所述胚培养基为：改良MS+琼脂粉8g/L+ 蔗糖10g/L，PH5. 8-6. 0,所述改良MS的配方见表1，培养基的配制方法依据常规方法配制。
[0027] (3)组培苗炼苗方法：
[0028] 经过25天的培养后，获得47棵三叶期的生根小苗，然后进行炼苗。即将三叶期 的生根小苗从培养瓶中取出，自来水冲洗除去琼脂，放到直径为3cm，高为20cm的大试管 中，自来水仅淹没小苗根部，试管口用透明保鲜膜封住，放入温度为25°C、空气相对湿度为 70%、光照强度为4000Lx的培养室中培养，每天光照时间为12小时，同时从炼苗的第一天 至第五天，每天用大头针在封口膜上刺出10-15个小孔，第六天将移栽到盛有土壤的培养 钵中，并放置于温室中按常规水稻水肥管理。
[0029] 此实施例得到47苗匕代，成苗率达到94%。经过田间种植，又进行了 2次回交和 2次自交，目前得到了 1000份后代株系，这些株系具有景洪普通野生稻的部份遗传特性，是 很好的种质创新材料，可以用于研宄解析景洪普通野生稻的优良性状和基因，也是用于培 育水稻新品系、新品种的优良亲本材料。
[0030] 表1本发明所述改良MS的配方
[0031]
[0032]
【主权项】
1. 一种提高野生稻与栽培稻远缘杂交胚挽救育种效率的方法，其特征在于包括以下步 骤： (1) 幼胚消毒处理 野生稻与栽培稻授粉后9-11天，取杂交后的种子剥去颖壳后，将种子用体积分数为 65%酒精处理30秒，再用质量分数为0. 2%的升汞溶液消毒处理10分钟，然后用无菌水清 洗6-7次，之后把种子放在灭菌吸水纸上于超净台上风干； (2) 幼胚接种培养 在超净台上，把种子上的胚乳刮除，保留完整的幼胚，把幼胚接种于装有胚培养基 的透明玻璃培养瓶中，将所述培养瓶置于温度为25 °C、空气相对湿度为70%、光照强 度为4000LX的光照恒温培养箱中培养，每天光照时间为12小时；所述胚培养基为：改 良MS+琼脂粉8g/L+蔗糖10g/L，pH5.8-6.0 ;所述改良MS的配方由以下大量元素、微量 元素、铁盐和有机成分组成：大量元素为：KNO31266mg/L，NH 4NO31100mg/L，KH2PO4170mg/ L，MgSO 4 ? 7H2O 37〇mg/L，CaCl2 ? 2H2O 440mg/L，微量元素为：KI 0? 83mg/L，H3BO36. 2mg/ L，MnSO4 ? 4H2011. 2mg/L，ZnSO4 ? 7H20 8. 6mg/L，Na2MoO4 ? 2H20 0? 25mg/L，铁盐为： Na2 ? EDTA37. 3mg/L，FeSO4 ? 7H20 27. 8mg/L，有机成分为：肌醇 100mg/L，甘氨酸 2mg/L ; (3) 组培苗炼苗 待幼胚形成三叶期的生根小苗后，从培养瓶中取出小苗用自来水冲洗去除琼脂，放到 试管中，加入自来水，自来水淹没小苗根部，进行炼苗处理，所述炼苗处理是：试管口用透明 保鲜膜封住，放入温度为25°C、空气相对湿度为70 %、光照强度为4000Lx的培养室中培养， 每天光照时间为12小时，同时从炼苗处理的第一天至第五天，每天用大头针在封口的保鲜 膜膜上刺出10-15个小孔，第六天将小苗移栽到盛有土壤的培养钵中，在温室或大棚中按 常规温室水稻栽培进行管理。
2. 根据权利要求1所述的提高野生稻与栽培稻远缘杂交胚挽救育种效率的方法，其 特征在于：所述野生稻为景洪普通野生稻（Oryza rufipogon Griff.)，所述栽培稻为粳稻 02428。
【专利摘要】本发明公开一种提高野生稻与栽培稻远缘杂交胚挽救育种效率的方法，属于生物学技术育种领域。该方法缩短了酒精消毒时间和降低了酒精浓度，为提高杂交种苗成活率奠定了基础；对胚培养基中的MS进行了改良，降低了KNO3、NH4NO3、KH2PO4和MnSO4·4H2O浓度，同时不加CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、烟酸、盐酸吡哆醇和盐酸硫胺素；在炼苗技术进行了创新，植株炼苗时，采用了操作方便，效果好的炼苗处理，大大提高了幼苗的成活率。本发明简化了胚挽救的操作，整个培育时间仅需30天，大大缩短了培育周期；同时大幅度地提高了成苗率，使成苗率达到94％，提高了野生稻与栽培稻远缘杂交胚挽救育种效率。
【IPC分类】A01H1-02, A01H4-00
【公开号】CN104871964
【申请号】CN201510323455
【发明人】程在全, 陈玲, 李定琴, 余腾琼, 肖素勤, 殷富有, 张敦宇, 钟巧芳, 柯学, 杨雅云, 付坚, 陈越, 王玲仙, 蒋聪, 罗红梅, 李娥贤, 将春苗, 曾民, 赵才美, 黄兴奇, 王波
【申请人】云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2015年6月12日