一株转化甘草酸生成甘草次苷的东乡野生稻内生真菌的制作方法
【专利摘要】一株转化甘草酸生成甘草次苷的东乡野生稻内生真菌，鉴定命名为AspergillusflavusDX-SEL2。已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC?NO：M2013686。该菌能在甘草酸作为诱导剂的转化培养基中诱导产生β-葡萄糖醛酸苷酶，进而水解去除甘草酸分子末端的一个葡萄糖醛酸基，生成甘草次苷（分泌在发酵液中）。用有机溶剂萃取、正相硅胶柱层析、反相柱层析等方法进一步分离纯化获得甘草次苷。本发明采用微生物催化转化，具有绿色环保无污染，转化步骤简单，产物单一，转化率高等优点。
【专利说明】一株转化甘草酸生成甘草次苷的东乡野生稻内生真菌
【技术领域】
[0001]本发明涉生物转化【技术领域】，特别是涉及一株转化甘草酸生成甘草次苷的东乡野生稻内生真菌。
【背景技术】
[0002]甘草酸(GL)是甘草中的主要活性成分之一。甘草酸的结构如图3，是由五环三萜皂苷通过糖苷键连接两个葡萄糖醛酸构成的。甘草酸经葡萄糖醛酸苷酶水解去除其末端的一个葡萄糖醛酸基就生成甘草次苷(如图3)。
[0003]甘草次苷又叫单葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)。甘草次苷(GAMG)的应用价值远远大于甘草酸。甘草次苷甜度是甘草酸的5倍，是蔗糖的941倍，是一种高甜度、低热量的新型甜味剂，可有效减少因高热量甜味剂的摄入引发的肥胖、糖尿病、高血脂症、龋齿等疾病；甘草次苷性质稳定，耐高温、耐酸、耐高压，在食品领域应用范围更广；作为药物，甘草次苷和甘草酸具有相同(或更强)的药理活性，如具有抗炎症、抗病毒、抗肿瘤、抗消化道溃疡、抗过敏、保肝、降血脂等作用，但甘草次苷中等极性，在体内溶解度较好的和较易跨膜转运，比甘草酸生物利用度更好；最重要的是甘草次苷比甘草酸更安全，甘草次苷的LD50为5000mg/kg，而甘草酸的LD50为805mg/kg。因此生产和开发甘草次苷具有很重要的应用价值和现实意义。
[0004]Kanaoka M 用化学合成法合成甘草次苷(M Kanaoka, Chem pharm Bull (Tokyo),1986,34(12):4978~4983.)但合成路线长，收率低。传统的化学水解法通过水解去掉甘草酸的葡萄糖醛酸基生成甘草次苷，但此法对甘草酸的两个糖苷键选择性低，不能定向水解生成甘草次苷，副产物多，得率较低，同时存在高耗能，高污染的缺点。此外，，根据欧盟和美国的立法，通过化学方法获得的产品不是天然物质，应用于食品领域受到限制，而利用酶法或微生物法(即生物转化法)得到的物质，被认为是天然物质。生物转化是指利用微生物、动植物和培养体系或其产生的酶对外源化合物进行结构修饰的生物化学反应过程，其本质是利用生物体系产生的酶对外源化合物进行酶催化反应。生物转化法转化甘草酸生成甘草次苷也有报道。根据已有报道，肠道细菌、动物组织中含有β_葡萄糖醛酸苷酶，能够转化甘草酸生成甘草次苷但其普遍存在转化的专一性偏低(不单单产生甘草次苷，还产生大量的副产物)、转化效率较低的缺点。从动物组织中提取葡萄糖醛酸苷酶，更是成本高，制备繁琐。
[0005]本发明人从禾本科植物东乡野生稻叶片组织中分离筛选出能够定向转化甘草酸生成甘草次苷的内生真菌——Aspergillus flavus DX-SEL2，该菌已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO:M 2013686。该菌能够在甘草酸(或甘草酸铵盐)的诱导下定向转化甘草酸生成甘草次苷，并且转化率较高，转化步骤简单，绿色环保无污染。
[0006] 此外，本发明首次发现内生真菌转化甘草酸生成甘草次苷，而且是和甘草毫无关联的禾本科植物东乡野生稻的内生真菌，这为寻找相关的高效转化菌株提供了新的研究思路。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一株东乡野生稻内生真菌As/76?rgi77w5.flavus DX-SEL2转化甘草酸定向生成甘草次苷，克服了现有技术中的催化定向性差，污染环境，高耗能，转化率低等不足。
[0008]本发明的转化甘草酸生成甘草次苷的东乡野生稻内生真菌，其分类命名为Aspergillus flavus DX-SEL2,是从东乡野生稻植物活体的叶片组织中采用内生真菌分离纯化技术分离获得，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2013年12月23日，保藏号为 CCTCC NO:M 2013686。
[0009]本发明所述的东乡野生稻内生真菌flavus DX-SEL2形态特征为:在PDA培养基上，28±2°C培养2天，菌落直径30~32mm，3天菌落直径为61~63mm，4天长满整个培养皿；质地丝绒状， 较厚，中央现絮状，菌落正面呈橄榄绿色，边缘略白色；反面淡黄色。分生孢子梗无色或浅棕色，直径为10~15ΜΠ1 ;分生孢子顶囊近乎球形，直径为50~65Mm,分生孢子球形至近球形,直径为2.5~4.5Mm。
[0010]本发明所述的东乡野生稻内生真菌flavuS DX-SEL2基因登录号为KC871017。
[0011]本发明所述的东乡野生稻内生真菌flavus DX-SEL2转化甘草酸定向生成甘草次苷包括以下步骤:
步骤一、将东乡野生稻内生真菌flavuS DX-SEL2,接种到PDA斜面培养基中培养活化72~84小时，并制作孢子悬浮液，然后接种至种子培养基中，28土 1°C，150~300r/min，摇床培养至对数生长期。
[0012]步骤二、按照10%~30%的接种量把上述对数生长期的种子液接种至含甘草酸的转化培养基中，转化产生甘草次苷至含量基本恒定。
[0013]步骤三、从发酵液中分离纯化甘草次苷。
[0014]优选的是,所述的flavus DX-SEL2转化甘草酸定向生成甘草次苷，步骤一中种子培养基的组成为:每升培养基中含葡萄糖10~40g，甘草酸(或甘草酸铵盐)
0.1 ~lg, KH2PO4L O ~3.0g, NH4NO3 2.0 ~5.0g, NaCl 0.3 ~0.8 g，酵母粉 0.05 ~0.3g, MgSO40.1 ~0.5g, CaCl20.01 ~0.5g, FeSO4 0.014g，ZnSO4.7H20 2.9mg, MnCl2.4H20
2.0mg, CuSO4.5H20 0.25mg, CoCl2.6H20 0.24mg, Na2MoO4.2H20 0.24mg, H3BO3 0.03mg,其余为纯水，调pH为5.0~7.0。
[0015]优选的是,所述的flavus DX-SEL2转化甘草酸定向生成甘草次苷，在步骤二中转化培养基组成为:每升培养基中含甘草酸(或甘草酸铵盐)2~30g，KH2PO4
1.0 ~3.0g, NH4NO3 2.0 ~4.0g, NaCl 0.3 ~0.8 g，酵母粉0.05 ~0.lg, MgSO4 0.1 ~0.5g,CaCl2 0.01 ~0.5g, FeSO4 0.014g，ZnSO4.7H20 2.9mg, MnCl2.4H20 2.0mg, CuSO4.5H20
0.25mg, CoCl2.6H20 0.24mg, Na2MoO4.2H20 0.24mg, H3BO3 0.03mg,其余为纯水，调 pH 为
3.5~9.0。其中甘草酸(或甘草酸铵盐)是菌体产葡萄糖醛酸苷酶的诱导剂。
[0016]优选的是,所述的乂5/76?/沿77^/5.flavus DX-SEL2转化甘草酸定向生成甘草次苷，在步骤二中培养条件为:28°C~60°C，转速150~300r/min，。
[0017]优选的是,所述的Χ.5/76?τ^777?5.flavus DX-SEL2转化甘草酸定向生成甘草次苷，在步骤三中甘草次苷的分离纯化包含以下步骤:
布氏漏斗抽滤或六层纱布过滤，收集滤液，用氯仿等体积萃取2~4次(萃出极性较低的杂质，而不会萃出甘草次苷)。水相继续用乙酸乙酯等体积萃取3~5次，得到乙酸乙酯相减压浓缩即为甘草次苷粗品。然后再用正相硅胶柱层析或反相柱层析等方法进一步纯化甘草次苷。
[0018]本发明所述的东乡野生稻内生真菌flavus DX-SEL2转化甘草酸定向生成甘草次苷的有益效果主要体现在:用微生物产生的酶作催化剂，反应效率高，专一性强，副产物少，步骤简单，绿色环保无污染。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为本发明所述东乡野生稻内生真菌flavus DX-SEL2的菌落形态；
图2为本发明所述东乡野生稻内生真菌flavuS DX-SEL2扫描电镜下孢子囊和孢子形态
图3甘草酸被β-葡萄糖醛酸苷酶水解生成甘草次苷
图4为本发明所述东乡野生稻内生真菌flavus DX-SEL2转化甘草酸产物的HPLC检测；
图5内生真菌flavus DX-SEL2转化甘草酸产物的LC-MS检测。
【具体实施方式】
[0020]以下结合实例对本发明进行细说明。
[0021]实施例1:本发明东乡野生稻内生真菌J5776?rgi77w5./Yara1S DX-SEL2的分离
(I)采集完整东乡野生稻，回到实验室立即处理。
[0022](2)根、茎部和叶子都采用75%乙醇浸5min表面初步灭菌，再用0.1 %升汞浸泡8min,无菌水漂洗组织表面灭菌的方式。
[0023](3)将上述处理好的茎用灭菌过的剪刀将两头剪掉，再将去掉两头的茎纵剖，一分为二，再剪成0.1X0. 5cm的小块。将叶子的边缘用灭过菌的剪刀剪去，把剪去了边缘的叶片也剪成约0.2X0.5cm的小块。将它们分别置于外加60 μ g/L链霉素和0.5g/L重铬酸钾的PDA培养基上，置28 °C培养箱中培养。为了检查表面灭菌效果，设对照进行灭菌效果的检验。对照1:将进行了灭菌操作的根、茎和叶子不剪去两头和边缘，然后将它们的表面与固体平板接触后取出，将培养皿放入培养箱培养；对照I1:最后一次洗涤用无菌水接入培养基中。每个处理重复3次。
[0024](4)发现接种组织周围长出菌落，用接种针挑取菌丝前端，接种到另一个培养基上。每天观察一次，如果长出菌落，立即挑出。
[0025](5)挑出的真菌形成菌落后，用接种针挑取菌丝前端，再接种到另一个培养基上，如此反复纯化4次，将菌种接到斜面培养基上4°C保存
实施例2:本发明筛选出定向转化甘草酸生成甘草次苷的东乡野生稻内生真菌Aspergillus flavus DX-SEL2。
[0026](I)平板初筛:将上述分离到的东乡野生稻的内生真菌活化，接种于甘草酸作为唯一碳源的固体筛选培养基中，对照组用葡萄糖代替甘草酸作为唯一碳源。28°C，培养7d，筛选出能生生长良好的菌株。
[0027]所述筛选培养基为；每升培养基中含甘草酸3.0 g，KH2PO4 2.2 g，NH4NO3 3.0 g，NaCl 0.5 g，酵母粉 0.05 g, MgSO40.12g, CaCl2 0.014g, FeSO4 0.014g，ZnSO4.7H20 2.9mg,MnCl2.4H20 2.0mg, CuSO4.5H20 0.25mg, CoCl2.6H20 0.24mg, Na2MoO4.2H20 0.24mg, H3BO3
0.03mg，琼脂粉20g (液体培养基不加)，其余为纯水，pH6.0。
[0028](2)摇瓶复筛:将上述平板初筛出来的菌株接种到种子培养基(用20g/L的葡萄糖替换筛选培养基中的3.0g/L的甘草酸)中28°C、150 rpm培养2d，然后按20%的接种量转接至甘草酸为唯一碳源的液体筛选培养基中，并设两个对照:一是的液体筛选培养基中不接入菌体，以检测甘草酸是否在培养基中分解)，二是将菌株转接到用葡萄糖代替甘草酸作为唯一碳源的筛选培养基中。28°C、150 rpm摇床培养4d，收集发酵液，用TLC、HPLC和LC~Ms检测转化的产物。
[0029]实验结果表明:东乡野生稻内生真菌flavus DX-SEL2能定向转化为甘草次苷(如图4、图5)，甘草酸转化率((起始GL摩尔浓度~转化后GL摩尔浓度)/起始GL摩尔浓度X 100%)为72.4%，甘草次苷产率(转化后GAMG摩尔浓度/起始GL摩尔浓度 X 100%)为 67.3%ο
[0030]实施例3:内生真菌Aspergillus flavus DX-SEL2转化甘草酸生成甘草次苷 将活化后的东乡野生稻内生真菌As/76?r^777w5.flavu S DX-SEL2接入到种子培养基
280C >250 rpm培养3d，然后按30%的接种量转接至转化培养基中，35°C、250 rpm摇床培养7d。离心去菌体，收集发酵液，用HPLc检测转化产物。
[0031]所述种子培养基的组成为:每升培养基中含葡萄糖25g，甘草酸(或甘草酸铵盐)0.2g，KH2PO4 2.0g, NH4NO3 3g，NaCl 0.5g，酵母粉 0.lg, MgSO4 0.12g，CaCl2 0.2g，FeSO40.014g, ZnSO4.7H20 2.9mg, MnCl2.4H20 2.0mg, CuSO4.5H20 0.25mg, CoCl2.6H20 0.24mg,Na2MoO4.2H20 0.24mg, H3BO3 0.03mg,其余为纯水，调 pH 为 6.0。
[0032]所述转化培养基组成为:每升培养基中含甘草酸单铵盐5g，KH2PO4 2.2g，NH4NO33g, NaCl 0.5g，酵母粉 0.1 g, MgSO4 0.12g, CaCl2 0.4g, FeSO4 0.014g，ZnSO4.7H20 2.9mg,MnCl2.4H20 2.0mg, CuSO4.5H20 0.25mg, CoCl2.6H20 0.24mg, Na2MoO4.2H20 0.24mg, H3BO30.03mg，其余为纯水，调pH为7.0。
[0033]转化结束后，抽滤去菌体得滤液并检测转化产物，检测结果为甘草酸转化率为90.5%,甘草次苷产率为85.3%。
[0034] 所得滤液用氯仿等体积萃取3次萃去极性较低的杂质，而不会萃出甘草次苷。水相继续用乙酸乙酯等体积萃取3~5次，得到乙酸乙酯相减压浓缩即为甘草次苷粗品，检测纯度为84.8%。
【权利要求】
1.一株转化甘草酸生成甘草次苷的东乡野生稻内生真菌，其特征是:所述的内生真菌是从东乡野生稻植物活体的叶片组织中采用内生真菌分离纯化技术分离获得，经微生物分类学鉴定命名为^577從炉77^5 fIavuS DX-SEL2，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2013年12月23日，保藏号为CCTCCNO:M 2013686，该菌能转化甘草酸生成甘草次苷。
2.如权利要求1所述的JrJrW1Sflavus DX-SEL2菌株，其特征在于:在PDA培养基上，28±1°C培养2天，菌落直径30~32mm，3天菌落直径为61~63mm，4天长满整个培养皿；质地丝绒状，较厚，中央现絮状，菌落正面呈橄榄绿色，边缘略白色；反面为淡黄色，分生孢子梗无色或浅棕色，直径为10~15Mm ;分生孢子顶囊近乎球形,直径为50~65Mm,分生孢子球形至近球形，直径为2.5~4.5Mm。
3.如权利要求1所述的flavusDX-SEL2菌株,其特征在于:其基因登录号为 KC871017。
4.如权利要求1所述的内生真菌flavuSDX-SEL2转化甘草酸生成甘草次苷的方法，其特征在于包括以下步骤: 步骤一、将内生真菌^577從炉77^5 flavus DX-SEL2，接种到PDA斜面培养基中培养活化72~84小时，并制作孢子悬浮液，然后接种至种子培养基中，25~35°C，150~300r/min，摇床培养至对数生长期； 步骤二、按照10%~40%的接种量把上述对数生长期的种子液接种至含甘草酸的转化培养基中，转化产生甘草次苷至含量基本恒定； 步骤三、从发酵液中分离纯化甘草次苷。
5.如权利要求4所述的内生真菌转化甘草酸生成甘草次苷的方法，其特征是，步骤一中种子培养基的组成为:每升培养基中含葡萄糖10~40g，甘草酸(或甘草酸铵盐)0.1~lg, KH2PO41.0 ~3.0g, NH4NO3 2.0 ~5.0g, NaCl 0.3 ~0.8 g，酵母粉 0.05 ~0.3 g,MgSO40.1 ~0.5g, CaCl20.01 ~0.5g, FeSO4 0.014g, ZnSO4.7H20 2.9mg, MnCl2.4H20 2.0mg，CuSO4.5H20 0.25mg, CoCl2.6H20 0.24mg, Na2MoO4.2H20 0.24mg, H3BO3 0.03mg,其余为纯水，调pH为5.0~7.0。
6.如权利要求4所述的内生真菌转化甘草酸生成甘草次苷的方法，其特征是，在步骤二中转化培养基组成为:每升培养基中含甘草酸(或甘草酸铵盐)2~30g，KH2PO4 1.0~3.0g, NH4NO3 2.0 ~4.0g, NaCl 0.3 ~0.8 g，酵母粉 0.05 ~0.lg, MgSO4 0.1 ~0.5g, CaCl20.01 ~0.5g, FeSO4 0.014g , ZnSO4.7H20 2.9mg, MnCl2.4H20 2.0mg, CuSO4.5H20 0.25mg,CoCl2.6Η20 0.24mg, Na2MoO4.2H20 0.24mg, H3BO3 0.03mg，其余为纯水，调 pH 为 3.5 ~9.0 ;其中甘草酸(或甘草酸铵盐)是菌体产β -葡萄糖醛酸苷酶的诱导剂。
7.如权利要求4所述的内生真菌转化甘草酸生成甘草次苷的方法，其特征是，在步骤二中培养条件为:28°C~60°C，转速150~300r/min。
8.如权利要求4所述的内生真菌转化甘草酸生成甘草次苷的方法，其特征是，在步骤三中甘草次苷的分离纯化包含以下步骤:布氏漏斗抽滤或六层纱布过滤，收集滤液，用氯仿等体积萃取2~4次，水相继续用乙酸乙酯等体积萃取3~5次，得到乙酸乙酯相减压浓缩即为甘草次苷粗品，然后再用正相硅胶柱层析或反相柱层析等方法进一步纯化甘草次苷。
【文档编号】C12N1/14GK103992953SQ201410057606
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年2月20日 优先权日:2014年2月20日
【发明者】朱笃, 李平, 张志斌, 高波良 申请人:江西师范大学