专利名称：一株产甘草苷的甘草内生真菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株内生真菌。
背景技术：
甘草为乌拉尔甘草(G. uralensis Fisch),胀果甘草(G. inf late Bat)和光果甘草(G. glabra L)的干燥根和根茎，国家二级保护植物。甘草是一种补益中草药，具有很多生理活性，如抗癌、抗变态、抑制SARS病毒以及抑制艾滋病毒等特殊功效。其主要成分甘草苷是一种黄酮类成分，具有解痉、抗溃疡、抑制酪氨酸酶活性、清除氧自由基的功效，还有抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌等作用。实验研究表明，植物与内生真菌在相互作用的过程中，有内生真菌能产生与植物相同或相似的活性物质，因此从药用植物中分离到产生活性物质的内生真菌已成为当今学者的研究趋势。·
发明内容
本发明提供了一株产甘草苷的甘草内生真菌。本发明产甘草苷的甘草内生真菌，它为枝顶抱菌(Acremonium dichromosporum)RP4，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No M 2012048，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2012年2月29日；它在PDA固体培养基上培养7d后，菌落直径为3 5cm，中心凸起，菌落为深绿色，基质为灰绿色，易生深绿色孢子，菌落边缘整齐呈白色，紧贴培养基，分生孢子聚成绳索状的菌索，分生孢子梗直立，锥形，直接长在菌丝细胞上，基部附近偶分枝，有隔膜，分生孢子单生，单细胞。本发明产甘草苷的甘草内生真菌，它为枝顶孢菌(Acremonium dichromosporum)RP4，其ITS序列提交至NCBI网页，通过Blast搜索与所得到的序列相似性高的序列，并通过所构建系统进化树，内生真菌RP4的ITS序列与(Acremonium dichromosporum,编号AB540572. I)菌株的相似性都达到了 98%以上，结合形态学观察结果，确定内生真菌RP4为枝顶抱菌(Acremonium dichromosporum)。本发明产甘草苷的甘草内生真菌，它为枝顶抱菌(Acremonium dichromosporum)RP4，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No M 2012048，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2012年2月29日。本发明利用微生物制药手段提取分离野生甘草健康植株的内生真菌，以抑菌活性为指标，采用滤纸片法进行抑菌实验，筛选得到抑菌活性较强的RP4，采用HPLC法为分析甘草内生真菌RP4的发酵液，结果在内生真菌RP4的发酵液中发现含有甘草苷，说明内生真菌RP4为产甘草苷的内生真菌。最后将获得的RP4菌株通过形态学观察和18S rDNA序列分析鉴定其种属。本发明甘草内生真菌RP4为枝顶抱菌(Acremonium dichromosporum),其代谢物具有较好的抑菌活性，同时从其代谢物中发现其含有甘草苷，本发明对采用甘草内生真菌RP4生产甘草苷具有指导意义。
图I为具体实施方式
一中枝顶抱菌(Acremonium dichromosporum)RP4的菌落形态图；图2为具体实 施方式一中枝顶抱菌(Acremonium dichromosporum)RP4的抱子显微结构图；图3为具体实施方式
一中枝顶抱菌(Acremonium dichromosporum) RP4基因组DNA的电泳图，其中M泳道表示Marker，G泳道表示RP4 ；图4为具体实施方式
一中枝顶抱菌(Acremonium dichromosporum) RP4的PCR扩增产物的电泳图，其中M泳道表示Marker，G泳道表示RP4 ；图5为具体实施方式
一中枝顶抱菌(Acremonium dichromosporum)RP4的系统进化树；图6为具体实施方式
一中甘草苷对照品的HPLC色谱图，其中a表示甘草苷；图7为具体实施方式
一中供试品RP4的HPLC色谱图，其中a表示甘草苷；图8为具体实施方式
一中加入对照品后供试品RP4的HPLC色谱图，其中a表示甘草苷；图9为具体实施方式
一中空白对照品的HPLC色谱图。
具体实施例方式具体实施方式
一本实施方式产甘草苷的甘草内生真菌，它为枝顶孢菌(Acremonium dichromosporum)RP4,已在中国典型培养物保藏中心保藏,保藏编号为CCTCCNo :M2012048，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2012年2月29日。本实施方式中枝顶抱菌(Acremonium dichromosporum) RP4,它在PDA固体培养基上培养7d后，菌落直径为3 5cm，中心凸起，菌落为深绿色，基质为灰绿色，易生深绿色孢子，菌落边缘整齐呈白色，紧贴培养基，分生孢子聚成绳索状的菌索，分生孢子梗直立，锥形，直接长在菌丝细胞上，基部附近偶分枝，有隔膜，分生孢子单生，单细胞。本实施方式中枝顶孢菌(Acremonium dichromosporum)RP4,其生长温度为28°C,生长pH值自然。本实施方式中产甘草苷的甘草内生真菌，它为枝顶孢菌(Acremoniumdichromosporum) RP4,该菌株分离自健康的野生甘草的根莖，采自大庆地区，植株年龄3年，植株健壮，无病虫害，其样本现存于黑龙江大学生命科学学院生物制药专业实验室；它按以下步骤进行分离培养选取健康的野生甘草的根茎用自来水冲洗干净后以无菌滤纸吸干水分，切成Icm小段，然后于无菌超净台内将甘草的根茎按下述方法进行表面消毒75%酒精浸泡lmin-2%次氯酸钠浸泡15min-无菌水冲洗3次；用无菌手术刀将野生甘草的根茎从中间切开，分别置于马铃薯固体分离培养基和马铃薯液体分离培养基中，于28°C恒温水浴摇床和恒温培养箱中，培养3 5d，待实验材料周围长出菌体，挑取菌体转入平板多次划线分离纯化，将纯化后的菌株置于斜面固体培养基中，4°C保存备用；其中马铃薯固体分离培养基每L由200g的马铃薯、20g的葡萄糖、20g的琼脂和余量的蒸馏水组成，pH值为7. O 7. 2，121 °C下高压灭菌30min ；马铃薯液体分离培养基每L由200g的马铃薯、20g的葡萄糖和余量的蒸馏水组成，pH值为7. 0 7. 2，121°C下高压灭菌30min ；斜面固体培养基为取5mL马铃薯固体分离培养基装于试管中，121°C高压灭菌30min后，铺成斜面冷却，以备保存菌种。结果从野生甘草的根茎中分离出内生真菌RP4，并且阴性对照中对照平板和对照液体培养基内均无任何菌长出，多次重复均如此，证明所分到的菌是植物内生真菌，而不是表面的附生菌。筛选出的内生真菌RP4根据《真菌分类学》、《真菌鉴定手册》和《半知菌属图解》进行形态学鉴定，其菌株的菌落特征和孢子形态与枝顶孢菌特征极为相近，菌落形态如图I所示,孢子显微结构如图2所示；分子鉴定内生真菌RP4发酵液抽滤得菌丝体用25%乙醇漂洗2次，灭菌的去离 子水冲洗2次，离心去上清液，然后采用SK1375真菌基因组DNA抽提试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)提取基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳后，0. 5mg/L的EB染色，紫外观察，结果如图3所示；然后进行目的片段的PCR扩增，PCR产物琼脂糖电泳后经凝胶纯化试剂盒SK1131胶回收纯化，成像结果如图4图所示。在550bp附近得到一扩增片段，证明已成功从RP4菌株中提取出其基因组DNA。纯化产物上海生工生物工程公司测序，测序结果的喊基序列见SEQ ID NO 1 ；测得的ITS序列在在NCBI数据库中应用BLAST分析进行同源性比较，应用MEGA5. 03软件中邻接法(Neighbour-joining methods, NJ)构建系统发育树(如图5所示)，确定目标菌株的分类地位。将内生真菌RP4的ITS序列提交至NCBI网页，通过Blast搜索与所得到的序列相似性高的序列，并通过所构建系统进化树，内生真菌RP4的ITS序列与(Acremonium dichromosporum,编号AB540572. I)菌株的相似性都达到了 98%以上，结合形态学观察结果，确定内生真菌RP4为枝顶孢菌(Acremonium dichromosporum)。采用琼脂块法测定甘草内生真菌RP4的抑菌活性将已分离到的内生真菌RP4接种于PDA培养基(200g的马铃薯、20g的葡萄糖、20g的琼脂和IOOOmL的水组成，pH自然，1211灭菌201^11)上，28°C培养4-7天，待培养基内有明显的颜色变化后，用直径为6mm的打孔器打取菌饼，放在含各种供试菌的平板上，做3个重复，用PDA培养基做阴性对照，用含链霉素和制霉素PDA培养基做阳性对照，制备好的平板在37°C恒温培养24h后观察，十字交叉法测量抑菌圈直径(O)。甘草内生真菌RP4对12种试验菌的抑菌活性实验结果见表I。表I
权利要求
1.ー株产甘草苷的甘草内生真菌，其特征在于它为枝顶孢菌(Acremoniumdichromosporum) RP4,已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No M2012048，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2012年2月29日。
全文摘要
一株产甘草苷的甘草内生真菌，它涉及一株内生真菌。产甘草苷的甘草内生真菌，它为枝顶孢菌(Acremonium dichromosporum)RP4，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NoM 2012048，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2012年2月29日。本发明甘草内生真菌RP4为枝顶孢菌(Acremonium dichromosporum)，其代谢物具有较好的抑菌活性，同时从其代谢物中发现其含有甘草苷，本发明对采用甘草内生真菌RP4生产甘草苷具有指导意义。
文档编号C12R1/645GK102676405SQ20121017118
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月29日 优先权日2012年5月29日
发明者孔德崴, 孙雅北, 白长胜, 谭佳音, 郑春英 申请人:黑龙江大学