专利名称：一株发酵刺五加提高刺五加中异秦皮啶含量的内生真菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株内生真菌。
背景技术：
刺五加为五加科植物刺五加(Acanthopanaxsenticosus (rupr. et Maxim.)Harms)的干燥根及根茎或茎，是既食又药功能性保健食品。刺五加的活性成分主要有异秦皮唳、紫丁香苷、多糖等，具有抗疲劳，抗炎，抗氧化、免疫调节，降压，降血糖等作用，现广 泛用于医药和食品行业。由于刺五加需求量上涨，森林面积逐渐减少以及盲目的采挖，使刺五加资源面临考验，目前刺五加是国家ニ类重点保护的濒危药用植物。发酵技术可以使食品的某些活性成分发生增减变化，保护食品中某些活性成分，节省资源，为食品、药品活性成分的获得提供新方法。
发明内容
本发明提供了一株发酵刺五加提高刺五加中异秦皮啶含量的内生真菌。本发明发酵刺五加提高刺五加中异秦皮啶含量的内生真菌，它为赭曲霉(Aspergillus ochraceus)AJ14,已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNo M 2012042，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2012年2月29日；它在PDA固体培养基上培养7d后，菌落直径为3 5cm，稍有放射状沟纹，具同心环纹，菌丝体白色，分生孢子面赭黄色，质地丝绒状，具少量无色渗出液，反面黄褐色，分生孢子头球形，分生孢梗茎壁粗糙，顶囊球形，直径25 45 μ m,表面全部可育，产孢结构双层，梗基大小为5 10 μ mX 3 4 μ m,瓶梗大小为8 11 μ mX 3 4 μ m ;分生孢子球形，直径2. 5 3. 5 μ m。本发明发酵刺五加提高刺五加中异秦皮啶含量的内生真菌，它为赭曲霉(Aspergillus ochraceus) AJ14,其ITS序列提交至NCBI网页,通过Blast搜索与所得到的序列相似性高的序列，并通过MEGA5. 03软件构建系统进化树，AJ14菌株的ITS序列与赭曲霉属菌菌株的相似性都达到了 98%以上，结合形态学观察结果，确定AJ14菌株为赭曲霉(Aspergillus ochraceus)。本发明发酵刺五加提高刺五加中异秦皮啶含量的内生真菌，它为赭曲霉(Aspergillus ochraceus)AJ14,已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNo M 2012042，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2012年2月29日。本发明采用分离自刺五加的内生真菌AJ14发酵刺五加，以刺五加中主要活性成分异秦皮啶为指标，比较其发酵前后异秦皮啶含量的动态变化，g在提高主要活性成分异秦皮啶的含量，为高效利用刺五加，节省药源、开发新型功能性保健食品提供依据。关于采用内生真菌AJ14发酵刺五加的相关研究目前未见报道。本发明刺五加内生真菌AJ14分离自健康的野生刺五加的茎。该菌株有孢子，其直径为25 μ m,通过形态学观察和18S rDNA序列分析鉴定为赭曲霉(Aspergillusochraceus)，它能使刺五加中异秦皮啶含量显著提高，因此在以获得异秦皮啶为目的的原料生产中可以选择刺五加内生真菌AJ14发酵刺五加以提高得率，节省药源。本发明发酵刺五加提高刺五加中异秦皮啶含量的内生真菌，它为赭曲霉(Aspergillus ochraceus) AJ14,采用AJ14对刺五加进行发酵，HPLC法测定刺五加发酵前后刺五加主要活性成分异嗪吡啶的含量,其结果显示,刺五加内生真菌AJ14能使刺五加主要活性成分异嗪吡啶在一定程度上得以显著提高，说明本发明对采用内生真菌AJ14发酵刺五加高效生产刺五加中的异秦皮啶成分、节省药源具有指导意义。
图I为具体实施方式
一中赭曲霉(Aspergillus ochraceus)AJ14的菌落形态图；图2为具体实施方式
一中赭曲霉(Aspergillus ochraceus)AJ14的孢子显微结构图；图3为具体实施方式
一中赭曲霉(Aspergillus ochraceus)AJ14基因组DNA的电泳图，其中M泳道表示Marker ；图4为具体实施方式
一中赭曲霉(Aspergillus ochraceus)AJ14的系统进化树；图5为具体实施方式
一中异嗪吡啶对照品的HPLC色谱图，其中I表示异嗪吡啶；图6为具体实施方式
一中刺五加茎的HPLC色谱图，其中I表示异嗪吡啶；图7为具体实施方式
一中刺五加莖经ム]14发酵后的HPLC色谱图,其中I表不异嗪吡啶。
具体实施例方式具体实施方式
一本实施方式发酵刺五加提高刺五加中异秦皮啶含量的内生真 菌，它为赭曲霉(Aspergillus ochraceus)AJ14,已在中国典型培养物保藏中心保藏,保藏编号为CCTCC No M 2012042，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2012年2月29日。本实施方式中赭曲霉(Aspergillus ochraceus)AJ14,它在PDA固体培养基上培养7d后，菌落直径为3 5cm，稍有放射状沟纹，具同心环纹，菌丝体白色，分生孢子面赭黄色，质地丝绒状，具少量无色渗出液，反面黄褐色，分生孢子头球形，分生孢梗茎壁粗糙，顶囊球形，直径25 45 μ m,表面全部可育，产孢结构双层，梗基大小为5 10μπιΧ3 4μπι，瓶梗大小为8 11 μ mX 3 4 μ m ;分生孢子球形，直径2. 5 3. 5 μ m。本实施方式中赭曲霉(Aspergillus ochraceus)AJ14,其生长温度为28°C,生长PH值为自然。本实施方式中发酵刺五加提高刺五加中异秦皮啶含量的内生真菌，它为赭曲霉 (Aspergillus ochraceus) AJ14,该菌株分离自健康的野生刺五加的莖，采自黑龙江省帽儿山地区,植株年龄3年,植株健壮,无病虫害。样品现存于黑龙江大学生命科学学院生物制药专业实验室；它按以下步骤进行分离培养选取健康的野生刺五加的茎用自来水冲洗干净后以无菌滤纸吸干水分，切成
0.5cm小段，于无菌超净台内将刺五加的茎按下述方法进行表面消毒75%酒精浸泡3 5min-2%次氯酸钠浸泡15min_无菌水冲洗4次。用无菌手术刀将样品从中间切开，分别置于马铃薯固体分离培养基和马铃薯液体分离培养基中，28°C恒温培养箱和摇床中培养，待其边缘及顶端长出菌丝后，及时挑取菌落转移到相应的培养基中；取最后一次冲洗刺五加茎的无菌水涂布培养平板或取适量此冲洗液倒入马铃薯液体分离培养基内作对照，另将消毒后的实验材料在培养平板上滚动一周作对照，于相同的条件下培养。其中马铃薯固体分离培养基每L由200g的马铃薯、20g的葡萄糖、20g的琼脂和余量的蒸馏水组成，pH值为7. O 7. 2，121 °C下高压灭菌30min ；马铃薯液体分离培养基每L由200g的马铃薯、20g的葡萄糖和余量的蒸馏水组成，pH值为7.0 7. 2，121°C下高压灭菌30min ；斜面固体培养基为取5mL马铃薯固体分离培养基装于试管中，121°C高压灭菌30min后，铺成斜面冷却，以备保存菌种。结果从野生刺五加茎中分离出内生真菌AJ14，并且阴性对照中对照平板和对照液体培养基内均无任何菌长出，多次重复均如此，证明所分到的菌是植物内生真菌，而不是表面的附生菌。筛选出的内生真菌根据《真菌分类学》、《真菌鉴定手册》和《半知菌属图解》进行形态学鉴定，菌株的菌落特征和孢子形态与赭曲霉属菌特征极为相近，菌落形态如图I所示，孢子显微结构如图2所示；分子鉴定内生真菌AJ14发酵液抽滤得菌丝体用25%こ醇漂洗2次，灭菌的去离子水冲洗2次，离心去上清液，然后采用上海生エUNIQ-10柱式真菌基因组抽提试剂盒提取基因组DNA,然后进行目的片段的PCR扩增(凝胶成像结果如图3所示)，在500bp (碱基序列见SEQID NO I)附近得到一扩增片段，证明已成功从AJ14菌株中提取出其基因组DNA;将含有目标条带的PCR产物全部进行再一次的点样，用2%的琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下用解剖刀将目的条带切下，用DNA胶回收试剂盒回收，制备大肠杆菌感受态细胞，将PCR产物与pMD18-T载体进行连接后，连接产物加入到感受态细胞中，进行进行菌落PCR验证。挑取单菌落进行大肠杆菌转化子的PCR检测，证明目的片段已成功转化进入感受态细胞中后，将克隆阳性菌株送上海生エ生物工程技术服务有限公司测序。所測定的核苷酸序列在NCBI数据库中应用BLAST分析进行同源性比较，井根据分子系统学研究的基本原理选择相应种属代表菌株的18S rDNA序列应用软件MEGA5. 03构建系统发育树，确定目标菌株的分类地位。测得的ITS序列提交至NCBI网页，通过Blast搜索与所得到的序列相似性高的序列，并通过MEGA5. 03软件构建系统进化树(如图4所示)，AJ14菌株的ITS序列与赭曲霉属菌菌株的相似性都达到了 98%以上，结合形态学观察結果，确定AJ14菌株为赭曲霉(Aspergillus ochraceus)。HPLC法測定内生真菌AJ14对刺五加发酵前后异秦皮啶的动态变化I供试品及对照品溶液的制备(I)色谱条件色谱柱VenusiLXBP-C18 柱(4. 6mm X 250mm, 5 μ m)；流动相0. 1%磷酸-こ腈(80 20)；流速ImL· mirf1 ；检测波长343nm；柱温25°C;进样量10 μし (2)对照品溶液的制备
精密称取异秦皮啶标准品各适量，以甲醇为溶剂分别制成质量浓度为I. Omg/mL的对照品储备液。精确量取对照品储备液lmL，制成质量浓度为O. 25mg/mL的对照品溶液。(3)供试品溶液制备发酵样品的制备取干燥的刺五加粉碎，过60目筛。精确称取粉碎后的刺五加15g，置于三角烧瓶中，按照I : 5的料液比加水，密封后，于121°C高压灭菌30min，取出，作为底物。将内生真菌AJ14在PDA培养基中活化，在已活化好的内生真菌AJ14中加入一定量的无菌水，制成I X 107CFU/mL的菌悬液。将5mL菌悬液加入到灭菌后的底物中；另取底物加入5mL无菌水作为空白对照样品，平行样品各10份，将所有样品放入摇床于37°C，培养15天,取出，冻干，备用。生药对照品溶液的制备取干燥的刺五加茎，粉碎，过40目筛。精密称取3份刺五加粉末各l.Og，精确加入IOmL甲醇，称重，超声提取60min，取出，放冷，以甲醇补足减失的溶剤，以O. 45 μ m微孔滤膜过滤后作为对照品溶液。发酵样品供试品溶液的制备精密称取经内生真菌AJ14发酵后的刺五加茎样品I. Og,精密加入IOmL甲醇，超声提取60min，取出，放冷，以甲醇补足减失的溶剂，用O. 45 μ m微孔滤膜过滤，即刺五加发酵样品供试品溶液。空白对照品溶液的制备取空白对照样品I. Og,精密加入IOmL甲醇，超声提取60min，取出，放冷，以甲醇补足减失的溶剤，用O. 45 μ m微孔滤膜过滤，即为空白对照品溶液。发酵液对照品溶液的制备精密量取刺五加内生真菌AJ14发酵液各IOOmL,旋转蒸发浓缩至10mL，以0. 45 μ m微孔滤膜过滤，即为发酵液对照品溶液。(3)样品測定在“(I)”色谱条件下，分别精密吸取10 μ L(三次平行)对照品溶液和各供试品溶液，进样，记录峰面积，按外标法计算含量。2检测结果在色谱条件下，供试品溶液与异秦皮啶对照品相应位置的色谱峰一致，而且色谱峰经过对照品加入法得到了较好的确认，结果见图5，图6，图7和表1，实验表明，经内生真菌AJ14发酵后，刺五加茎中异嗪吡啶的含量有极显著的提高。表I刺五加茎中异嗪吡啶的含量测定结果
权利要求
1.一株发酵刺五加提高刺五加中异秦皮啶含量的内生真菌，其特征在于它为赭曲霉(Aspergillus ochraceus) AJ14,已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNo M 2012042，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2012年2月29日。
全文摘要
一株发酵刺五加提高刺五加中异秦皮啶含量的内生真菌，它涉及一株内生真菌。发酵刺五加提高刺五加中异秦皮啶含量的内生真菌，它为赭曲霉(Aspergillus ochraceus)AJ14，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NoM 2012042，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2012年2月29日。本发明中赭曲霉AJ14对刺五加进行发酵，HPLC法测定刺五加发酵前后刺五加主要活性成分异嗪吡啶的含量，刺五加内生真菌AJ14能使刺五加主要活性成分异嗪吡啶在一定程度上得以显著提高，说明本发明对采用内生真菌AJ14发酵刺五加高效生产刺五加中的异秦皮啶成分、节省药源具有指导意义。
文档编号C12R1/66GK102676404SQ201210171139
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月29日 优先权日2012年5月29日
发明者崔宇, 徐翠, 郑春英 申请人:黑龙江大学