专利名称：水曲柳悬浮培养体系的建立方法
技术领域：
一种利用基本培养基和附加不同激素成份对水曲柳悬浮培养体系的建立方法，本发明属于植物细胞工程技术领域。
背景技术：
水曲柳(Fraxinusm andshu rica.)属于木犀科白腊树属，是一种高大落叶乔木，为我国东北珍贵的“三大硬阔”之一，木材材质优良，纹理美观，广泛应用于各领域。国外已有研究发现其树皮中含有香豆素类成分，包括秦皮甲素(Esculin)，秦皮乙素(Esculetin),秦皮苷(Fraxin),异秦皮定(Isofraxidin),白腊树精(Mandshurin, Fraxinol) 0香豆素类化合物不仅能直接抑制癌细胞，而且可以通过增 强机体免疫力产生抗癌作用。但目前香豆素类化合物主要来自于木樨科白蜡树树皮和叶中，这极大的造成了资源的浪费和破坏，不利于可持续发展。如果能运用细胞工程手段，利用细胞大量培养及代谢产物分离，提高水曲柳中香豆素类物质含量，同时避免季节性对生产带来的影响，这将对水曲柳中香豆素的生产与利用具有重要的意义。以单细胞或小细胞团作为对象进行水曲柳细胞、基因工程等研究具有很大优势，因为单细胞或小细胞团受周围细胞和微环境影响较小，而且遗传上比较稳定；生长速度快，通过生物技术手段对再生植株进行选择，可大大缩短育种年限。目前，对水曲柳组织培养研究主要通过嫩茎尖直接再生苗、休眠冬芽萌动、种子直接发芽。而利用愈伤组织再生及悬浮细胞培养还未见报道。
发明内容
本发明目的是在于提供一种水曲柳悬浮体系建立的方法，方法易行，操作方便，增殖速度块，可加快水曲柳的快速繁殖。为达到上述目的，本发明采用以下技术措施I.以水曲柳叶柄作为外植体，用75%酒精浸泡10-30s，用O. 1%的Ca(ClO)2处理2-5min，用无菌水冲洗3_6次；2.将消毒好的叶柄在培养皿中用无菌刀切割成O. 5_2cm左右的小段，接种于固体培养基中，培养基的有效成分为=WPM培养基和附加成份，附加成份为TDZ O. 1-1. Omg/L+NAA O. 5-2. Omg/L+ 琼脂 5000_8000mg/L+ 蔗糖 2%_3% ；3.光照培养，温度25_28°C，每天光照10_16h，培养10_30d ；4.将诱导出的愈伤组织用无菌刀切成O. 4-0. 8cm,接种到含有30_50mL液体培养基的100-150mL的三角瓶中，每瓶接种愈伤组织30-50块，置于转速为100_130r/min的摇床上，温度25-28°C，每天光照10-16h，培养10_15d继代一次。培养及成份为WPM培养基和附加成份，附加成份为BA O. 05-0. 5mg/L+2, 4-D O. 1-1. Omg/L+蔗糖2%-3%。WPM培养基的成份(单位mg/L)
大量元素①NH4NO3400②KH2PO4170③MgS04.7H20370④K2SO4990
钙盐①Ca (NO3) 2 · 4H20556②CaCl2 · 2H2096微量元素①Na2MoO4 · 2H20O. 25②MnSO4 · H2O22. 5③ZnSO4 · 7H208. 6④CuSO4 · 5H20O. 25⑤H3BO36. 2铁盐①FeSO4 · 7H2027. 8②Na2-EDTA37. 3有机物①肌醇100②维生素BII. O③烟酸O. 5④维生素B6O. 5⑤甘氨酸2. O⑥肌醇100本发明水曲柳悬浮培养体系的建立方法主要具有以下几方面的优点I.生产成本低，可实现工业化生产本发明以液体作为培养基，去除琼脂，本发明方法的成本相比于传统的固体培养技术有显著降低，可实现工业化生产。2.细胞繁殖速度快采用本发明细胞细胞悬浮培养方法，水曲柳可在15-20d获得大量单细胞和细胞团，可用于生物反应器培养，可大大提高繁殖率，繁殖率可达10倍以上。
图I水曲柳悬浮细胞系侧面观察2水曲柳悬浮细胞系底部观察图
具体实施例方式本发明的目的在于提供了一种水曲柳悬浮培养体系的建立方法，方法易行，操作方便，增殖速度快，可加快水曲柳的快速繁殖。为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施I.以水曲柳茎段作为外植体，用75%酒精浸泡IOs或20s或25s或28s或30s，用O.1%的Ca (ClO) 2处理2min或3min或5min，用无菌水冲洗3次或4次或5次或6次；2.将消毒好的茎段在培养皿中用无菌刀切割成O. 5-2cm左右的小段，接种于固体培养基中，培养基的有效成分为=WPM培养基和附加成份，附加成份为TDZ O. 1-1. Omg/L+NAA O. 5-2. Omg/L+ 琼脂 5000_8000mg/L+ 蔗糖 2%_3% ；3.光照培养，温度25_28°C，每天光照10_16h，培养10_30d ；4.将诱导出的愈伤组织用无菌刀切成O. 4-0. 8cm,接种到含有30_50mL液体培养基的100-150mL的三角瓶中，每瓶接种愈伤组织30-50块，置于转速为100_130r/min的摇床上，温度25-28°C，每天光照10-16h，培养10_15d继代一次。培养及成份为WPM培养基和附加成份，附加成份为BA O. 05-0. 5mg/L+2, 4-D O. 1-1. Omg/L+蔗糖 2%-3% ；5.连续继代培养3-5次，获得生长均匀稳定的细胞系。
权利要求
1.一种水曲柳(Fraxinusm andshu rica.)愈伤组织细胞悬浮体系的培养方法,包括以下步骤(I)水曲柳的外植体消毒后接种在启动培养基上，得到愈伤组织；(2)将步骤(I)所得岛的无菌愈伤组织，切成小块，接种到液体培养基中；(3)置于摇床上振荡、光照培养；(4)继代培养后可得到悬浮细胞系。
2.按照专利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(I)中所述的水曲柳外植体为水曲柳的茎段。
3.按照专利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(I)中所述的消毒方式是用75%酒精浸泡10-30s，用O. 1%的Ca(ClO)2处理2_5min，用无菌水冲洗3-6次。
4.按照专利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(I)中所述的启动培养基的组成为WPM+TDZ O. 1-1. Omg/L+NAA O. 5-2. Omg/L+ 琼脂 5000-8000mg/L+ 蔗糖 2%_3%。
5.按照专利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(I)中所述的液体培养基的组成为WPM+BA O. 05-0. 5mg/L+2, 4-D O. 1-1. Omg/L+ 蔗糖 2%_3%。
6.按照专利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(I)中所述的振荡、光照培养条件为摇床转速为100-130r/min，温度25_28°C，每天光照10_16h。
7.按照专利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(I)中所述的继代培养时间为10-20d继代一次，连续继代培养3-5次。
全文摘要
本发明提供了一种水曲柳悬浮细胞体系的建立方法，1)以水曲柳茎段作为外植体，诱导愈伤组织，在添加激素TDZ和BA、蔗糖、琼脂的WPM固体培养基上获得愈伤组织；2)将步骤1)中得到的愈伤组织接种到添加激素BA和2,4-D、蔗糖的WPM液体培养基中，振荡培养。3)培养10-15d继带一次，连续继带培养3-5个继带，获得生长均匀、快速增殖的悬浮细胞系。本发明具有繁殖速度快、培养规模大和提供大量均匀植物细胞培养物的特点。
文档编号C12N5/02GK102888379SQ20121043719
公开日2013年1月23日 申请日期2012年11月6日 优先权日2012年11月6日
发明者齐凤慧, 詹亚光, 曾凡锁 申请人:东北林业大学, 齐凤慧, 詹亚光