专利名称：长爪沙鼠原代肝细胞的培养方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种简便实用的长爪沙鼠原代肝细胞的培养方法。
背景技术：
我国长爪沙鼠的实验动物化研究始于1978年，目前我国主要有两个长爪沙鼠群，分别保存于浙江省实验动物中心和首都医科大学。长爪沙鼠对食物中的脂肪、维他命EJi固醇敏感，可作为研究食物源性胆固醇诱导的高胆固醇血症的动物模型。长爪沙鼠肝脏中低密度脂蛋白受体的表达与食物源蛋白显著相关，而人肝癌细胞的低密度脂蛋白受体表达则无显著变化，表明在研究细胞表面受体时原代肝细胞较瘤化的肝细胞系具有优势。值得注意的是长爪沙鼠的脂代谢与人类的脂代谢有诸多相似。长爪沙鼠血液中载脂蛋白与高密度脂蛋白胆固醇水平呈高度正相关，与人类代谢研究结果一致；低密度脂蛋白是脂蛋白胆固醇的主要载体，与人类相近；对红花油、橄榄油或椰子油的反应都与人相似。此外，长爪沙鼠是杂食性动物，由贫瘠的荒漠地带至实验室环境，饮食结构中脂质含量显著增加，与国民饮食结构改善类似。且长爪沙鼠个体小、易管理，因而是研究脂代谢的良好动物模型。肝脏在脂质代谢中起着重要作用，它能合成脂蛋白，有利于脂质运输，也是脂肪酸氧化和酮体形成的主要场所。肝脏主导胆固醇代谢，胆固醇在肝脏中合成，并可转变成胆汁酸盐随胆汁排出，同时肝脏还能将碳水化合物转变成脂肪。肝细胞是肝脏众多功能的最终承担者，肝细胞的体外培养成为很多体外实验研究的前提，治疗药物的研发、细胞周期的调控、激素与受体的相互作用等都广泛地应用离体肝细胞模型。原代肝细胞较好保留并维持了肝细胞形态的完整性和体外代谢活性，可以在接近生理浓度的情况下开展研究，并排除了其他器官、组织的影响。原代肝细胞培养已广泛应用于药物的体外代谢研究，它能在较短时间内得到大量的代谢产物，相对而言易于控制代谢条件、代谢体系单纯，在研究药物代谢途径、代谢机制和药物相互作用，尤其在代谢物结构鉴定方面具有较大的优越性。中国专利申请CN200910031021.9中公开了一种大鼠肝细胞分离培养的方法。大鼠用戊巴比妥钠麻醉，并给予肝素钠抗凝，做门静脉插管，两步灌流法灌流，取下消化成熟肝脏，收集肝细胞于4°C含1%牛血清白蛋白(BSA)的HANKS液中，肝细胞悬液用筛网过滤，滤液离心、沉淀后，收集沉淀于LEIBOVITZ’ S-15 (L-15)完全培养基中，调整肝细胞密度为3 6 X IO5个/mL接种于铺鼠尾胶原的培养板中，于37°C、5%C02环境中培养。接种后4h换液去除未贴壁及死细胞，继续培养20h后可用于试验。但该方法并不适用于长爪沙鼠肝细胞的培养。理想的肝细胞是该体外模型建立的前提，高产量、高活性、功能良好的肝细胞是其关键因素。目前国内尚无关于长爪沙鼠原代肝细胞离体模型的研究，国外也尚未建立完善的培养体系
发明内容
本发明旨在针对目前长爪沙鼠肝细胞培养方法的空缺，提供了一种简便实用的长爪沙鼠原代肝细胞的培养方法，为长爪沙鼠肝细胞应用于科学研究提供技术保障。—种长爪沙鼠原代肝细胞的培养方法，包括步骤( I)从消化成熟的离体长爪沙鼠肝脏中收集肝细胞初悬液，过滤，滤液除杂后加入含5%小牛血清的Hank' s平衡盐溶液(Hanks Balanced SaltSolutions,简称HBSS),反复离心洗涤，收集细胞沉淀于含20%新生牛血清的DMEM完全培养基中，调整肝细胞浓度为
3.OX IO5个 5. OX IO5个/mL，制备成肝细胞悬液；(2)将肝细胞悬液接种于铺有鼠尾胶原的培养板中，于37°C、5%C02环境中培养，4h 后除去死亡及悬浮细胞，将培养基更换成含细胞因子的维持培养基，细胞贴壁过夜后，得到长爪沙鼠原代肝细胞。步骤(2)中，所述的含细胞因子的维持培养基为在DMEM基础培养基中加入10%新生牛血清、5 μ g/mL胰岛素、4 μ g/mL地塞米松、10ng/mL表皮细胞生长因子、5ng/mL肝细胞生长因子和2% 二甲基亚砜(DMS0);pH=7. 0-7. 4。含细胞因子的维持培养基的配制方法包括在DMEM基础培养基中加入新生牛血清、胰岛素、地塞米松、表皮细胞生长因子、肝细胞生长因子和DMS0，混合均匀，调节pH=7. 0-7. 4，制得含细胞因子的维持培养基，其中，新生牛血清的浓度为10%，胰岛素的浓度为5 μ g/mL，地塞米松的浓度为4 μ g/mL，表皮细胞生长因子的浓度为10ng/mL，肝细胞生长因子的浓度为5ng/mL，DMSO的浓度为2%。所述的含细胞因子的维持培养基的pH值优选为7. 0-7. 2，进一步优选为pH=7. 0，更利于长爪沙鼠原代肝细胞的成活。步骤(I)中，所述的过滤包括依次用100目和200目钢筛过滤。100目钢筛主要过滤肉眼可见的大的组织碎块，200目钢筛过滤微小碎块。如果直接用200目钢筛过滤，将导致大的组织碎块堵塞筛孔，使细胞得率大大降低、过滤耗时延长、增大了细胞受污染的可能性。步骤(I)中，所述的除杂包括18°C _28°C静置后过滤。步骤(I)中，所述的反复离心洗漆优选包括800rpm离心3min、600rpm离心3min、400rpm离心3min及400rpm离心3min,弃上清。rpm为转/分钟。步骤(I)中，调整肝细胞浓度优选为4. O X IO5个 5. O X IO5个/mL。所述的消化成熟的离体长爪沙鼠肝脏采用本领域现有方法得到，如胶原酶原位灌流法，一般可采用以下方法将长爪沙鼠用速眠新麻醉，同时注射肝素钠抗凝，用连接注射器的留置针行门静脉插管，首先用无钙灌流液开放灌流至肝脏呈土黄色或灰白色，接着用含钙的O. 025%胶原酶液开放灌流，2min后夹闭下腔静脉，继续灌注含钙胶原酶液至肝脏充盈，待肝脏消化成熟，柔软、压之留痕时开放下腔静脉，分离得到肝脏。本发明DMEM基础培养基，是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基。一般在DMEM基础培养基中添加血清、抗生素等中的一种或多种物质后，得到DMEM完全培养基。本发明所用的试剂和培养基等均采用市售产品，%除特别说明外，均指质量百分比。本发明方法得到的长爪沙鼠原代肝细胞变平变薄，核圆易见，逐渐呈岛屿状。相对于现有技术，本发明具有如下效果本发明的培养方法中，选用含20%新生牛血清的DMEM完全培养基制备肝细胞悬液，并辅助使用经过鼠尾胶原包被的培养板接种肝细胞，细胞贴壁效果更好，接种后4h即可形成单层紧密排列贴壁生长；选用含细胞因子的维持培养基对长爪沙鼠原代肝细胞进行贴壁培养，培养的肝细胞能够保留许多长爪沙鼠体内肝细胞的细胞功能和活性，可用于探索肝脏疾病机理、筛选防治药物等的研究。本发明的培养方法中，采用的试剂及培养基等均可市售得到，价格低廉，经济实用，操作简便易行，获得的肝细胞贴壁牢、活力高，培养细胞的成活率高，稳定可靠，适于大规模生产。
图I为新分离的长爪沙鼠肝细胞200倍倒置 显微镜下观察图；图2为实施例I中培养24h后的长爪沙鼠肝细胞200倍倒置显微镜下观察图；图3为实施例I中培养48h后的长爪沙鼠肝细胞200倍倒置显微镜下观察图；图4为实施例I中培养72h后的长爪沙鼠肝细胞200倍倒置显微镜下观察图；图5为实施例I中长爪沙鼠肝细胞台盼蓝染色后200倍倒置显微镜下观察图；图6为新分离的长爪沙鼠肝细胞PAS染色后200倍倒置显微镜下观察图；图7为实施例I中培养24h后的长爪沙鼠肝细胞PAS染色后200倍倒置显微镜下观察图；图8为实施例I中培养48h后的长爪沙鼠肝细胞PAS染色后200倍倒置显微镜下观察图；图9为实施例I中培养72h后的长爪沙鼠肝细胞PAS染色后200倍倒置显微镜下观察图。
具体实施例方式本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明，应理解这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。本发明中所使用的百分浓度，除特别说明外，均指质量百分浓度。实施例I取禁食16h的长爪沙鼠，以速眠新(lmL/kg)肌肉注射麻醉，腹腔注射O. ImL(12500IU/mL)肝素钠抗凝，置解剖板上固定，胸腹部消毒开腹，静脉留置针门静脉插管固定，先用37°C水浴预热的无钙灌流液开放灌流至肝脏呈灰白色，灌流20ml。接着灌注钙浓度为O. 025%含钙的IV型胶原酶液，刚开始时缓慢开放灌注，2min后夹闭下腔静脉，继续灌注胶原酶液使肝脏充盈，待肝脏柔软塌陷、压之留痕后停止灌注。胶原酶消化总时间为8min,体积共IOml。分离肝脏，将肝脏置于含5%小牛血清的DMEM完全培养基的培养皿中，小心撕开肝包膜，轻轻抖落肝细胞，制备成肝细胞初悬液。肝细胞初悬液分别用100目、200目钢筛过滤，滤液室温下静置15min使活细胞沉降，去除组织碎屑、死细胞，加入含5%小牛血清的 HBSS 离心洗漆 4 次，即800rpm 3min>600rpm 3min>400rpm 3min、400rpm3min,弃上清，向沉淀中加入含20%新生牛血清的DMEM完全培养基(贴壁培养基)中，调整肝细胞浓度为5. O X IO5个/mL，制备成肝细胞悬液。将肝细胞悬液接种于预先铺有鼠尾胶原的培养板，37°C、5%C02条件下培养。培养4h细胞贴壁后去除死亡及未贴壁细胞，培养基更换成含细胞因子的维持培养基，培养20h后细胞变平变薄，多呈双核细胞，之后逐渐呈岛屿状连接，形态良好。细胞分离纯化台盼蓝染色计算产量及活率，用倒置显微镜进行形态学观察，并用过碘酸-雪夫反应(PAS)鉴定肝细胞。含细胞因子的维持培养基是在DMEM基础培养基中加入10%新生牛血清、5 μ g/mL胰岛素、4 μ g/mL地塞米松、10ng/mL表皮细胞生长因子、5ng/mL肝细胞生长因子、2%DMS0，pH 7. O。新分离的长爪沙鼠肝细胞经分离纯化后置于倒置显微镜下观察，镜下可见活细胞呈光亮圆形，饱满，透亮度好，见图I。培养24h后可见细胞拉平变薄，体积增大，多呈双核细胞，见图2。培养48h后，细胞呈多边形展开，几个细胞聚集在一起，呈散落的岛样，见图3。培养72h后，细胞展开程度增大，呈成片的岛屿状连接，见图4。新分离的长爪沙鼠肝细胞做 台盼蓝排斥试验，活细胞透亮，死细胞呈明显的蓝色(颜色较深)，活率为95%，见图5。PAS染色后，高倍镜下观察到新分离的长爪沙鼠肝细胞由于含有大量的糖原颗粒而被染成红色，见图6。肝细胞培养24h (图7)、48h (图8)、72h (图9)后，虽然细胞形态发生变化，但PAS染色后胞浆均呈红色或紫红色，鉴定培养后的细胞仍为长爪沙鼠肝细胞。实施例2取禁食16h的长爪沙鼠，以速眠新(lmL/kg)肌肉注射麻醉，腹腔注射O. ImL(12500IU/mL)肝素钠抗凝，置解剖板上固定，胸腹部消毒开腹，静脉留置针门静脉插管固定，先用37°C水浴预热的无钙灌流液开放灌流至肝脏呈灰白色，灌流20ml。接着灌注钙浓度为O. 025%含钙的IV型胶原酶液，刚开始时缓慢开放灌注，2min后夹闭下腔静脉，继续灌注胶原酶液使肝脏充盈，待肝脏柔软塌陷、压之留痕后停止灌注。胶原酶消化总时间为8min,体积共IOml。分离肝脏，将肝脏置于含5%小牛血清的DMEM完全培养基的培养皿中，小心撕开肝包膜，轻轻抖落肝细胞，制备成肝细胞初悬液。肝细胞初悬液分别用100目、200目钢筛过滤，滤液室温下静置15min使活细胞沉降，去除组织碎屑、死细胞，加入含5%小牛血清的 HBSS,离心洗漆 4 次，即800rpm 3min、600rpm 3min、400rpm 3min、400rpm 3min,弃上清，向沉淀中加入含20%新生牛血清的DMEM完全培养基(贴壁培养基)中，调整肝细胞浓度为3. OX IO5个/mL，制备成肝细胞悬液。将肝细胞悬液接种于预先铺有鼠尾胶原的培养板，37°C、5%C02条件下培养。培养4h细胞贴壁后去除死亡及未贴壁细胞，培养基更换成含细胞因子的维持培养基，培养20h后细胞变平变薄，多呈双核细胞，之后逐渐呈岛屿状连接，形态良好。细胞分离纯化台盼蓝染色计算产量及活率，用倒置显微镜进行形态学观察，并用过碘酸-雪夫反应(PAS)鉴定肝细胞。含细胞因子的维持培养基是在DMEM基础培养基中加入10%新生牛血清、5 μ g/mL胰岛素、4 μ g/mL地塞米松、10ng/mL表皮细胞生长因子、5ng/mL肝细胞生长因子、2%DMS0，pH 7. 4。新分离的长爪沙鼠肝细胞经分离纯化后置于倒置显微镜下观察，镜下可见活细胞呈光亮圆形，饱满，透亮度好。培养24h后可见细胞拉平变薄，体积增大，多呈双核细胞。培养48h后，细胞呈多边形展开，几个细胞聚集在一起，呈散落的岛样。培养72h后，细胞展开程度增大，呈成片的岛屿状连接。新分离的长爪沙鼠肝细胞做台盼蓝排斥试验，活细胞透亮，死细胞呈明显的蓝色(颜色较深)，活率为90%。PAS染色后，高倍镜下观察到新分离的长爪沙鼠肝细胞由于含有大量的糖原颗粒而被染成红色。肝细胞培养24h、48h、72h后，虽然细胞形态发生变化，但PAS染色后胞浆均呈红色或紫红色，鉴定培养后的细胞仍为长爪沙鼠肝细胞。实施例3取禁食16h的长爪沙鼠，以速眠新(lmL/kg)肌肉注射麻醉，腹腔注射O. ImL(12500IU/mL)肝素钠抗凝，置解剖板上固定，胸腹部消毒开腹，静脉留置针门静脉插管固定，先用37°C水浴预热的无钙灌流液开放灌流至肝脏呈灰白色，灌流20ml。接着灌注钙浓度为O. 025%含钙的IV型胶原酶液，刚开始时缓慢开放灌注，2min后夹闭下腔静脉，继续灌注胶原酶液使肝脏充盈，待肝脏柔软塌陷、压之留痕后停止灌注。胶原酶消化总时间为8min,体积共IOml。分离肝脏，将肝脏置于含5%小牛血清的DMEM完全培养基的培养皿中，小心撕开肝包膜，轻轻抖落肝细胞，制备成肝细胞初悬液。肝细胞初悬液分别用100目、200 目钢筛过滤，滤液室温下静置15min使活细胞沉降，去除组织碎屑、死细胞，加入含5%小牛血清的 HBSS,离心洗漆 4 次，即800rpm 3min、600rpm 3min、400rpm 3min、400rpm 3min,弃上清，向沉淀中加入含20%新生牛血清的DMEM完全培养基(贴壁培养基)中，调整肝细胞浓度为4. OX IO5个/mL，制备成肝细胞悬液。将肝细胞悬液接种于预先铺有鼠尾胶原的培养板，37°C、5%C02条件下培养。培养4h细胞贴壁后去除死亡及未贴壁细胞，培养基更换成含细胞因子的维持培养基，培养20h后细胞变平变薄，多呈双核细胞，之后逐渐呈岛屿状连接，形态良好。细胞分离纯化台盼蓝染色计算产量及活率，用倒置显微镜进行形态学观察，并用过碘酸-雪夫反应(PAS)鉴定肝细胞。含细胞因子的维持培养基是在DMEM基础培养基中加入10%新生牛血清、5 μ g/mL胰岛素、4 μ g/mL地塞米松、10ng/mL表皮细胞生长因子、5ng/mL肝细胞生长因子、2%DMS0，pH 7. 2。新分离的长爪沙鼠肝细胞经分离纯化后置于倒置显微镜下观察，镜下可见活细胞呈光亮圆形，饱满，透亮度好。培养24h后可见细胞拉平变薄，体积增大，多呈双核细胞。培养48h后，细胞呈多边形展开，几个细胞聚集在一起，呈散落的岛样。培养72h后，细胞展开程度增大，呈成片的岛屿状连接。新分离的长爪沙鼠肝细胞做台盼蓝排斥试验，活细胞透亮，死细胞呈明显的蓝色(颜色较深)，活率为93%。PAS染色后，高倍镜下观察到新分离的长爪沙鼠肝细胞由于含有大量的糖原颗粒而被染成红色。肝细胞培养24h、48h、72h后，虽然细胞形态发生变化，但PAS染色后胞浆均呈红色或紫红色，鉴定培养后的细胞仍为长爪沙鼠肝细胞。
权利要求
1.一种长爪沙鼠原代肝细胞的培养方法，其特征在于，包括步骤 (1)从消化成熟的离体长爪沙鼠肝脏中收集肝细胞初悬液，过滤，滤液除杂后加入含5%小牛血清的HanV s平衡盐溶液，反复离心洗涤，收集细胞沉淀于含20%新生牛血清的DMEM完全培养基中，调整肝细胞浓度为3. O X IO5个 5. O X IO5个/mL，制备成肝细胞悬液； (2)将肝细胞悬液接种于铺有鼠尾胶原的培养板中，于37°C、5%C02环境中培养，4h后除去死亡及悬浮细胞，将培养基更换成含细胞因子的维持培养基，细胞贴壁过夜后，得到长爪沙鼠原代肝细胞。
2.根据权利要求I所述的长爪沙鼠原代肝细胞的培养方法，其特征在于，所述的含细胞因子的维持培养基为在DMEM基础培养基中加入10%新生牛血清、5 μ g/mL胰岛素、4μ g/mL地塞米松、10ng/mL表皮细胞生长因子、5ng/mL肝细胞生长因子和2% 二甲基亚砜；pH=7. 0-7. 4。
3.根据权利要求2所述的长爪沙鼠原代肝细胞的培养方法，其特征在于，所述的含细胞因子的维持培养基pH=7. 0-7. 2。
4.根据权利要求2所述的长爪沙鼠原代肝细胞的培养方法，其特征在于，所述的含细胞因子的维持培养基pH=7. O。
5.根据权利要求I所述的长爪沙鼠原代肝细胞的培养方法，其特征在于，步骤(I)中，所述的过滤包括依次用100目和200目钢筛过滤。
6.根据权利要求I所述的长爪沙鼠原代肝细胞的培养方法，其特征在于，步骤(I)中，所述的除杂包括18°C _28°C静置后过滤。
7.根据权利要求I所述的长爪沙鼠原代肝细胞的培养方法，其特征在于，步骤(I)中，所述的反复离心洗漆包括800rpm离心3min、600rpm离心3min、400rpm离心3min及400rpm离心3min,弃上清。
8.根据权利要求I所述的长爪沙鼠原代肝细胞的培养方法，其特征在于，步骤(I)中，调整肝细胞浓度为4. O X IO5个 5. O X IO5个/mL。
全文摘要
本发明公开了一种长爪沙鼠原代肝细胞的培养方法，包括(1)从消化成熟的离体长爪沙鼠肝脏中收集肝细胞初悬液，过滤，滤液除杂后加入含5%小牛血清的HBSS，反复离心洗涤，收集细胞沉淀于含20%新生牛血清的DMEM完全培养基中，调整肝细胞浓度为3.0×105个～5.0×105个/mL，制备成肝细胞悬液；(2)将肝细胞悬液接种于铺有鼠尾胶原的培养板中，于37℃、5%CO2环境中培养，4h后除杂，将培养基更换成含细胞因子的维持培养基，细胞贴壁过夜后，得到长爪沙鼠原代肝细胞。该方法价格低廉，经济实用，操作简便易行，获得的肝细胞贴壁牢、活力高，培养细胞的成活率高，稳定可靠，适于大规模生产。
文档编号C12N5/071GK102952776SQ20121043716
公开日2013年3月6日 申请日期2012年11月5日 优先权日2012年11月5日
发明者陈立青, 郭红刚, 李长龙, 卢领群, 萨晓婴, 戴方伟, 宋晓明 申请人:浙江省医学科学院