专利名称：用于鉴定小麦春化基因vrn-a1和vrn-d1的pcr体系的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于鉴定或辅助鉴定小麦春化基因VRN-Al和VRN-Dl的PCR体系及其应用，特别涉及一种用于鉴定或辅助鉴定小麦春化基因VRN-Al和VRN-Dl的PCR引物对组、试剂盒及其应用。
背景技术：
春化阶段是小麦生长发育的基本阶段之一。小麦的春化反应与其生育期及适应性密切相关，是指导小麦区划和新品种推广的主要依据之一，受春化基因控制。春化基因决定小麦全生育周期长短的7(T75%。Iwaki和Van Beem等研究表明，世界不同地区小麦品种的春化基因组成存在差异，反映了不同生态类型对品种春化反应的要求不同。春化基因VRN-I编码的蛋白为MADS-box转录因子，受低温诱导促进开花，是普通小麦春化作用的一类主要基因，包括3个位点VRN-A1、VRN-Bl和VRN-D1，分别位于5A、5B和染色体长臂上。3个基因位点不同的等位变异对春化作用的效应不同，显性等位变异Vm-Al的效应最强，表现为对春化作用高度不敏感，同时对Vrn-Bl和Vrn-Dl位点基因具有上位性效应；显性等位变异Vrn-Bl和Vrn-Dl对春化作用的敏感性较弱，两者之间未发现彼此间的上位作用。Yan和Fu等发现，VRN-I春化基因变异类型受其启动子区和第一个内含子区决定。在普通小麦中，VRN-Al位点有4种变异类型，分别为Vrn-Ala、Vrn-Alb、Vrn-Alc和vrn-Al，其中 Vrn-Ala、Vrn-Alb 和 Vrn-Alc 表现为显性，vrn-Al 为隐性；VRN_B1 和 VRN-Dl位点一般通常存在两种等位变异类型，即显性和隐性等位变异。与隐性等位变异类型相比，显性等位变异Vrn-Ala和Vrn-Alb分别在启动子区域插入和缺失了一定数量的碱基序列，而显性Vrn-Alc、Vrn-Bl和Vrn-Dl在第一个内含子序列出现了大片段碱基的缺失。在普通小麦中，VRN-Al位点存在4种等位变异，需要用3对引物分别进行3次PCR检测；VRN-B1和VRN-Dl位点两种等位变异，需要用两对引物分别进行两次PCR检测。为此，检测I个小麦材料春化基因VRN-I的3个位点等位变异组成，需要连续进行7次PCR检测，检测程序繁琐，实验成本高。多重PCR这一概念自1988年由Chambercian等提出后，由于其快速、高效、低成本等一系列的优点，使得这项技术在生命科学领域得到了广泛的应用，如植物种质纯度鉴定、植物分子育种、植物病虫害检测等。利用多重PCR技术，在同一个PCR反应体系中加入两对或两对以上特异性引物进行扩增，可以同时检测出多个等位变异类型，降低检测成本，提高效益。
发明内容
本发明的目的是提供用于鉴定或辅助鉴定待测小麦春化基因的多重PCR引物对组、试剂盒，以及利用所述多重PCR引物对组鉴定或辅助鉴定待测小麦春化基因的方法。本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定待测小麦春化基因的多重PCR引物对组，由引物对组A和引物对组B组成；所述引物对组A由特异于所述VRN-Al基因的两个引物对组成；所述引物对组B由特异于所述VRN-Dl基因的两个引物对组成；
所述引物对组A中，所述特异于VRN-Al基因的两个引物对分别为序列表中序列I 和序列2所示的两条单链DNA组成的引物对1，以及序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的引物对2 ；
所述引物对组B中，所述特异于VRN-Dl基因的两个引物对分别为序列表中序列5 和序列6所示的两条单链DNA组成的引物对3，以及序列5和序列7所示的两条单链DNA组成的引物对4。
其中，序列I由20个核苷酸组成；序列2由20个核苷酸组成；序列3由20个核苷酸组成；序列4由20个核苷酸组成；序列5由21个核苷酸组成；序列6由19个核苷酸组成；序列7由21个核苷酸组成。
本发明中，所述VRN-Al基因有四个等位基因，分别是Vrn-Ala、Vrn-Alb, Vrn-Alc 和vrn-Al (前三个表现为显性，最后一个表现为隐性)；所述VRN-Dl基因有两个等位基因， 分别是Vrn-Dl和vrn-Dl (前一个表现为显性，后一个表现为隐性)。
所述引物对组A中，所述序列I、所述序列2、所述序列3和所述序列4共四条单链 DNA在PCR反应体系中的摩尔 比为f I. 5 Γ . 5 Γ . 5 Γ . 5 ;所述引物对组B中，所述序列5、所述序列6和所述序列7共三条单链DNA在PCR反应体系中的摩尔比为f I. 5 Γ . 5 Γ . 5。
在本发明的一个实施例中，所述引物对组A中，所述序列I、所述序列2、所述序列 3和所述序列4共四条单链DNA在PCR反应体系中的摩尔比为I : I I I ;所述引物对组B 中，所述序列5、所述序列6和所述序列7共三条单链DNA在PCR反应体系中的摩尔比为I : I :1。
含有所述引物对组的试剂盒也属于本发明的保护范围。
所述引物对组的制备方法也属于本发明的保护范围。
该引物对组的制备方法可包括将所述引物对组中各序列所示单链DNA分别单独包装的步骤。
所述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。
该试剂盒的制备方法可包括如下步骤将所述引物对组中各序列所示单链DNA分别单独包装后，与下述物质中的至少一种包装在同一试剂盒内PCR反应缓冲液、DNA聚合酶和4种dNTP。
鉴定或辅助鉴定待测小麦含有Vrn-Ala、Vrn-Alb、Vrn-Alc和vrn-Al这四种基因中哪一种，以及含有Vrn-Dl和vrn-Dl这两种基因中哪一种的方法也属于本发明的保护范围。
该方法具体可包括如下(I)和(2)步骤
所述(I)为如下bl)和b2):
bl)以待测小麦的基因组DNA为模板，用所述引物对组中的所述引物对组A进行 PCR反应，所述PCR反应的退火温度为60°C ；
b2)以待测小麦的基因组DNA为模板，用所述引物对组中的所述引物对组B进行 PCR反应，所述PCR反应的退火温度为65°C ；
(2)检测步骤(I)得到的PCR产物的大小，按照如下方法根据PCR产物确定所述待测小麦含有Vrn-Ala、Vrn-Alb、Vrn-Alc和vrn-Al这四种基因中哪一种，以及含有Vrn-Dl和vrn-Dl这两种基因中哪一种以所述引物对组A进行PCR反应，若所述PCR产物中同时含有715bp和624bp的两个DNA片段，则所述待测小麦含有或候选含有Vrn-Ala基因；若所述PCR产物中含有473bp 的DNA片段，则所述待测小麦含有或候选含有Vrn-Alb基因；若所述PCR产物中含有493bp的DNA片段、同时不含有1068bp的DNA片段，则所述待测小麦含有或候选含有Vrn-Alc基因；若所述PCR产物中同时含有493bp和1068bp的两个DNA片段，则所述待测小麦含有或候选含有vrn-Al基因；以所述引物对组B进行PCR反应，若所述PCR产物中含有1671bp的DNA片段，则所述待测小麦含有或候选含有Vrn-Dl基因；若所述PCR产物中含有997bp的DNA片段，则所述待测小麦含有或候选含有vrn-Dl基因。本发明的又一个目的是提供一种培育半冬性小麦品种的方法。所述半冬性小麦品种对温度要求介于冬性和春性之间，在O 7°C条件下，经过15 35天，可以通过春化阶段。没有经过春化的种子在春季播种不能抽穗或延迟抽穗，抽穗不整齐，产量很低。遗传学上认为，半冬性小麦品种含有VRN-Al以外的一个或者多个显性等位变异。因此，培育半冬性小麦品种的方法具体可包括采用同时含有或候选含有vrn-Al基因和Vrn-Dl基因的小麦作为亲本进行育种的步骤。从众多小麦品种中选择同时含有或候选含有vrn-Al基因和Vrn-Dl基因的小麦的方法，即为上述鉴定或辅助鉴定待测小麦含有Vrn-Ala、Vrn-Alb、Vrn-Alc和vrn-Al这四种基因中哪一种，以及含有Vrn-Dl和vrn-Dl这两种基因中哪一种的方法。本发明的再一个目的是提供一种培育春性小麦品种的方法。所述春性小麦品种通过春化阶段时对温度要求范围较宽，经历时间也较短。一般在秋播地区要求O 12°C，北方春播地区要求在O 20°C，经过15天的时间可以通过春化阶段。培育春性小麦品种的方法具体可包括采用含有Vrn-Ala基因、Vrn-Alb基因和Vrn-Alc基因中至少一种的小麦作为亲本进行育种的步骤。从众多小麦品种中选择满足上述条件的小麦的方法，即为上述鉴定或辅助鉴定待测小麦含有Vrn-Ala、Vrn-Alb、Vrn-Alc和vrn-Al这四种基因中哪一种，以及含有Vrn-Dl和vrn-Dl这两种基因中哪一种的方法。本发明根据春化基因VRN-Al和VRN-Dl的STS标记，基于目标基因组成已知材料的验证结果，分别建立检测2个春化基因位点等位变异的多重PCR体系，以期为春化基因VRN-I的快速检测提供更加简便、准确的方法。本发明所提供的PCR引物对组中各引物对之间不存在相互抑制作用和错配，检测品种的结果可靠、重复性好，成本低。本发明所提供的PCR引物对组中的各引物对均选用同样的退火温度，实现了相同温度一次PCR完成一组基因的鉴别，且特异性强，检测过程耗时短。本发明对检测小麦品种的冬春性，进而提高育种的效率，加强对育种高代的选择具有重要意义；另外，本发明使得在小麦推广和引种过程中，有更强的目标性。
图I为12个小麦品种春化基因VRN-I的位点VRN-Al的多重PCR扩增图谱。其中，泳道M为标准分子量DL2000 ;泳道I为新春16 ;泳道2为龙辐麦I号；泳道3为中国春；泳道4为北京10号；泳道5为甘麦8号；泳道6为大白皮；泳道7为龙辐麦3号；泳道8为辽春10号；泳道9为龙麦20 ;泳道10为皖麦33 ;泳道11为宁春37 ;泳道12为德麦3号。
图2为12个小麦品种春化基因VRN-I的位点VRN-Dl的多重PCR扩增图谱。其中， 泳道M为标准分子量DL2000 ;泳道I为中国春；泳道2为西农1376 ;泳道3为宁春37 ;泳道4为北京10号；泳道5为新春16 ;泳道6为皖麦33 ;泳道7为龙辐麦3号；泳道8为农大139 ;泳道9为大白皮；泳道10为豫麦7号；泳道11为陇春8号；泳道12为德麦3号。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明所涉及的小麦品种新春16、龙福麦I号、中国春、北京10号、甘麦8号、大白皮、龙辐麦3号、辽春10号、龙麦20、皖麦33、宁春37、德麦3号、农大139、豫麦7号和陇春 8号均为市面常售品种，均可从商业途径获得。
实施例I、小麦春化基因VRN-Al的多重PCR检测
本实施例的多重PCR引物对组由特异于VRN-Al基因的两个引物对组成。所述特异于VRN-Al基因的两个引物对分别为序列表中序列I和序列2所示的两条单链DNA组成的引物对1，以及序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的引物对2。
本实施例的多重PCR引物对组可同时检测VRN-Al基因位点的4种基因型，即三个显性等位变异基因Vrn-Ala、Vrn-Alb、Vrn-Alc和一个隐性等位变异基因vrn-Al。含有 Vrn-Ala基因的材料，PCR同时扩增出715bp和624bp的两个条带；含有Vrn-Alb基因的材料，PCR扩增出473bp的条带；含有Vrn-Alc基因的材料，PCR扩增出493bp的条带，同时扩增不出1068bp的条带；含有vrn-Al基因的材料，PCR同时扩增出493bp和1068bp的两个条带。
一、小麦春化基因VRN-Al的多重PCR扩增
I、小麦基因组的制备
采用CTAB法对12份已知基因型的小麦品种进行基因组DNA的提取，得到对应于 12份已知基因型的小麦品种的基因组DNA，作为春化基因VRN-Al多重PCR扩增的模板。其中，12份已知基因型的小麦品种为新春16、龙福麦I号、中国春、北京10号、甘麦8号、大白皮、龙辐麦3号、辽春10号、龙麦20、皖麦33、宁春37和德麦3号。Zhang等(Zhang X-K, Xiao Y-G. ,Zhang Y,Xia X-Cj Dubcovsky Jj He Z-H. Allelic Variation at the Vernalization Genes Vrn-Alj Vrn-Blj Vrn-Dlj and Vrn_B3 in Chinese Wheat Cultivars and Their Association with Growth Habit. Crop Science，2008，48:458-471.)披露了这 12 个小麦品种的春化基因VRN-I的基因位点VRN-Al的具体基因型，详见表I。
表I已知基因型小麦品种春化基因VRN-I的基因位点VRN-Al的基因型
权利要求
1.用于鉴定或辅助鉴定待测小麦春化基因的多重PCR引物对组，所述小麦春化基因为VRN-Al基因和VRN-Dl基因，其特征在于所述多重PCR引物对组由引物对组A和引物对组B组成；所述引物对组A由特异于所述VRN-Al基因的两个引物对组成；所述引物对组B由特异于所述VRN-Dl基因的两个引物对组成；所述引物对组A中，所述特异于VRN-Al基因的两个引物对分别为序列表中序列I和序列2所示的两条单链DNA组成的引物对1，以及序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的引物对2 ;所述引物对组B中，所述特异于VRN-Dl基因的两个引物对分别为序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成的引物对3，以及序列5和序列7所示的两条单链DNA组成的引物对4。
2.根据权利要求I所述的引物对组，其特征在于所述引物对组A中，所述序列I、所述序列2、所述序列3和所述序列4共四条单链DNA在PCR反应体系中的摩尔比为f I. 5 Γ1. 5 Γ1. 5 Γ1. 5 ;所述引物对组B中，所述序列5、所述序列6和所述序列7共三条单链DNA在PCR反应体系中的摩尔比为I I. 5 Γ . 5 Γ . 5。
3.根据权利要求2所述的引物对组，其特征在于所述引物对组A中，所述序列I、所述序列2、所述序列3和所述序列4共四条单链DNA在PCR反应体系中的摩尔比为1:1:1:1;所述引物对组B中，所述序列5、所述序列6和所述序列7共三条单链DNA在PCR反应体系中的摩尔比为I :1 :1。
4.含有权利要求1-3中任一所述引物对组的试剂盒。
5.权利要求1-3中任一所述引物对组的制备方法，其特征在于所述制备方法包括将权利要求1-3中任一所述引物对组中各序列所示单链DNA分别单独包装的步骤。
6.权利要求4所述PCR试剂盒的制备方法，包括如下步骤将权利要求1-3中任一所述的引物对组中各序列所示单链DNA分别单独包装后，与下述物质中的至少一种包装在同一试剂盒内=PCR反应缓冲液、DNA聚合酶和4种dNTP。
7.鉴定或辅助鉴定待测小麦含有Vrn-Ala、Vrn-Alb、Vrn-Alc和vrn_Al这四种基因中哪一种，以及含有Vrn-Dl和vrn_Dl这两种基因中哪一种的方法，包括如下(I)和(2)的步骤所述(I)为如下bl)和b2)bl)以待测小麦的基因组DNA为模板，用权利要求1-3中任一所述引物对组中的所述引物对组A进行PCR反应，所述PCR反应的退火温度为60°C ；b2)以待测小麦的基因组DNA为模板，用权利要求1-3中任一所述引物对组中的所述引物对组B进行PCR反应，所述PCR反应的退火温度为65°C ；(2)检测步骤(I)得到的PCR产物的大小，按照如下方法根据PCR产物确定所述待测小麦含有Vrn-Ala、Vrn-Alb、Vrn-Alc和vrn_Al这四种基因中哪一种，以及含有Vrn-Dl和vrn-Dl这两种基因中哪一种以所述引物对组A进行PCR反应，若所述PCR产物中同时含有715bp和624bp的两个DNA片段，则所述待测小麦含有或候选含有Vrn-Ala基因；若所述PCR产物中含有473bp的DNA片段，则所述待测小麦含有或候选含有Vrn-Alb基因；若所述PCR产物中含有493bp的DNA片段、同时不含有1068bp的DNA片段，则所述待测小麦含有或候选含有Vrn-Alc基因；若所述PCR产物中同时含有493bp和1068bp的两个DNA片段，则所述待测小麦含有或候选含有vrn-Al基因；以所述引物对组B进行PCR反应，若所述PCR产物中含有1671bp的DNA片段，则所述待测小麦含有或候选含有Vrn-Dl基因；若所述PCR产物中含有997bp的DNA片段，则所述待测小麦含有或候选含有vrn-Dl基因。
8.一种培育半冬性小麦品种的方法，包括采用通过权利要求7的方法鉴定得到的同时含有或候选含有vrn-Al基因和Vrn-Dl基因的小麦作为亲本进行育种的步骤。
9.一种培育春性小麦品种的方法，包括采用通过权利要求7的方法鉴定得到的含有Vrn-Ala基因、Vrn-Alb基因和Vrn-Alc基因中至少一种的小麦作为亲本进行育种的步骤。
全文摘要
本发明公开了一种用于鉴定或辅助鉴定小麦春化基因VRN-A1和VRN-D1的引物对组及其应用。本发明所提供的引物对组由引物对组A和引物对组B组成；所述引物对组A中的四条引物由序列1、序列2、序列3和序列4所示DNA单链组成；所述引物对组B的三条引物由序列5、序列6和序列7所示DNA单链组成。本发明所提供的引物对组中各引物对之间不存在相互抑制作用和错配，检测结果可靠、重复性好，成本低，且特异性强，检测过程耗时短；本发明对检测小麦品种的冬春性，进而提高育种的效率，加强对育种高代的选择具有重要意义；另外，本发明使得在小麦推广和引种过程中，有更强的目标性。
文档编号C12Q1/68GK102925572SQ20121043696
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月5日 优先权日2012年11月5日
发明者穆培源, 张晓科, 相吉山, 张影全, 桑伟, 徐红军, 韩新年, 聂迎彬, 崔凤娟, 邹波 申请人:新疆农垦科学院