专利名称：：一种建立多年生黑麦草高频再生体系的方法
技术领域：
：本发明一种建立多年生黑麦草高频再生体系的方法，属于植物组织培养方法，可用于基因枪法和农杆菌介导法等基因转化的受体材料培养。
背景技术：
：目前，利用基因工程培育和改良植物品种是一种便捷和实用的途径。成功的植物基因转化首先依赖于良好的植物受体系统。这种用于转基因的植物受体系统必须具有高频、稳定的再生能力，对转化筛选剂有良好的敏感性。植物组织培养和再生体系的建立和完善是遗传转化的基础和前提。然而由于禾本科植物自身的特点，许多牧草和草坪草的组织培养和再生体系不完善，使得禾本科草的转基因操作和应用研究较为困难。多年生黑麦草是禾本科黑麦草属草本植物，属于冷季型草坪草，是温带地区重要的草坪和牧草草种之一。其叶片质地细、柔软、叶色绿，成坪速度快，具有防治水土流失、防风固沙的作用。但多年生黑麦草耗水量大、高温高湿条件下易发生病害等缺点，限制了其在城市绿地中的应用。由于自交不亲和，传统遗传改良困难而复杂，组织培养和基因转化技术对其提供了新的育种途径。自Ahloowalia以未成熟种子为外植体成功诱导愈伤获得再生植株后，通过多年生黑麦草茎尖分生组织培养、悬浮细胞和原生质体培养及花药培养等都获得了再生植株，但植株再生率普遍较低。多年生黑麦草的幼叶、幼胚、成熟胚和茎尖分生组织培养都可以产生愈伤组织，但来自幼叶和茎尖分生组织的愈伤很难分化出植株，幼胚培养操作困难，只有少数基因型的成熟胚培养可产生具有较强再生能力的愈伤组织。多年生黑麦草种子多含抗病抗虫的植物内生菌，个别品种种子内生菌感染率高达90％，种子的彻底消毒比较困难。由于多年生黑麦草组织和细胞培养难度大，所建立的转基因受体体系只限于个别基因型，且再生植株的能力较差，以至于采用转基因技术改良多年生黑麦草的工作进展缓慢。因此找到合适的受体系统，为基因枪法和农杆菌介导法的转化提供良好的受体材料，对多年生黑麦草细胞工程和基因工程研究均有重要意义。
发明内容本发明的目的是提供一套建立多年生黑麦草高频稳定再生体系的方法，可有效的克服基因型的制约，以及防止现有方法所培养出的胚性愈伤组织在继代培养过程中逐渐丧失绿苗分化的能力，从绝大多数基因型的培养细胞再生出转基因植株，且诱导和再生频率高，再生植株性状变异小，取材不受季节限制，从而保障基因枪法和农杆菌介导法基因转化工作得以顺利进行。本发明的主要步骤包括多年生黑麦草的外植体消毒，以其成熟胚为外植体诱导愈伤组织，胚性愈伤组织的继代增值培养及植株再生，小苗的生根培养和再生苗的移栽。本发明与现有技术相比具有如下优点和积极效果(1)选取了诱导多年生黑麦草愈伤组织的最佳外植体，并确定了不受基因型影响的外植体消毒方式。该外植体取材简便且不受季节限制，消毒方式不仅效果好而且降低了对植物材料的损伤和对操作人员的危害。(2)在离体培养条件下，通过调控愈伤组织诱导培养基中的各激素和添加物浓度，有效提高了多年生黑麦草胚性愈伤组织的诱导率，且在继代培养过程中始终保持其胚性结构，为转化工作提供了大批受体材料。(3)调控分化培养基中各激素和添加物的浓度，使再生率达到60％，从而建立起多年生黑麦草高频稳定的再生体系，为基因转化工作奠定了有利的基础。(4)再生苗的生根率可以达到90％以上，移栽成活率亦为100％。使用本发明方法培养的胚性愈伤组织，用基因枪法和农杆菌介导法均已分别将DREB1A转录因子以及CMO-BADH双基因导入多年生黑麦草“爱神特”(Accent)中；并且通过基因枪法将DREB1A转录因子转入多年生黑麦草“特拉华”(Delaware)和“尤文图斯”(Juventus)中，获得了一大批抗旱耐盐碱的转基因植株。附图简要说明图1多年生黑麦草继代后愈伤组织；图2多年生黑麦草再生植株；图3多年生黑麦草再生植株根系；图4多年生黑麦草盆栽苗；图5多年生黑麦草移栽苗根系。(5张图均为爱神特品种)具体实施例方式取8-10ml体积的多年生黑麦草种子放入50ml的离心管中，加入约40ml次氯酸钠原液(活性氯7％)和1滴Tween-20，密封，置于磁力搅拌器上消毒35-40min。超净工作台中，用在20-30ml无菌水手动清洗6次以上。20ml无菌水4℃浸泡10-12h，再次用无菌水清洗后即可直接接种。本发明中所用的灭菌剂次氯酸钠降低了对植物材料的损伤和对操作人员的危害，不仅能够彻底的清除种子表面的细菌和杂质，对寄生于的多年生黑麦草种子内真菌的杀菌效果也较好；采用磁力搅拌消毒，使种子与次氯酸钠充分接触，种皮大量脱落，利于剥胚工作以及形成愈伤组织。实验材料选取7个品种多年生黑麦草成熟种子特拉华(Delaware)、托亚(Taya)、尤文图斯(Juventus)、绿宝石(Emerald)、爱神特(Accent)、卡特(Cutter)和超级德比(Derbysupreme)。分别以其种子、成熟胚、胚根和胚轴为外植体进行愈伤组织的诱导，25℃全黑暗培养。诱导培养基为MS+4.0mg/L2，4-D+0.2mg/L6-BA+0.1g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+3g/L琼脂，pH＝5.8。通过实验比较，成熟胚的出愈率和胚性愈伤率均较其他外植体高，种子次之，胚根和胚轴的诱导效果较差。发明中涉及到的相关培养基愈伤诱导培养基是指MS+4-6mg/L2，4-D+0.2-0.3mg/L6-BA+0.1g/L水解酪蛋白；分化培养基是指MS+0.1-0.2mg/L6-BA+0.4-0.6mg/LNAA+0.3-0.5mg/LZT+6.4mg/LCu2+；生根培养基是指MS+0.4mg/LNAA+0.1mg/LZT。愈伤组织诱导是指将外植体接入愈伤诱导培养基中，25℃全黑暗培养，将长出的芽用镊子拔掉，但要注意不能将生长点拔掉，一般需拔3次。25d后长出白色或淡黄色的愈伤组织，由于种子个体差异，愈伤大小不一。将去掉胚的愈伤进行继代培养，25d后挑取胚性愈伤组织分成小块再次继代或进行预培养，此时的胚性愈伤组织即可作为转化受体。出愈率(出愈率＝愈伤数/外植体数×100％)最高可达97.9％，不同品种间有一定的差异，平均在50.1％-91.2％之间。胚性愈伤率(胚性愈伤率＝胚性愈伤数/外植体数×100％)最高可达46.0％，各品种平均在10.1％-23.4％之间。愈伤组织的分化是指随机将获得的愈伤组织(而不是胚性愈伤组织)接入再生培养基中，25℃光照16h培养，30d后统计其出芽情况。再生率(再生率＝再生苗数/愈伤组织数×100％)最高可达95％，七个品种间存在一定差异，平均在37.8％-60.0％之间。再生苗中白化苗的比率很少。由于实验品种尤文图斯是专门为草坪培育的四倍体品种，其出愈率、胚性愈伤率和再生率均为各品种平均值中的最低。本发明所采用的方法和培养基适于绝大多数多年生黑麦草的组培再生。小苗的生根是指将分化出来小苗转移到生根培养基中，25℃光照16h培养。20d后大部分小苗都能生根，未生根的小苗在更新培养基后也会生根。当再生苗的根系比较发达后，在室温下炼苗3d后，清洗掉基部的培养基，直接栽入到花盆中，自然光下生长，根系发达，均能够成活。花盆中基质为沙∶土∶草炭＝1∶1∶1。实施例实施例1利用本发明获得过年生黑麦草爱神特和超级德比的高频再生体系植物材料多年生黑麦草爱神特和超级德比成熟种子。接种前预处理将适量种子浸入加有一滴Tween-20的次氯酸钠原液(活性氯7％)中搅拌消毒40min，无菌水清洗6次以上。4℃低温浸泡12h，再次用无菌水清洗后，部分种子直接接种到愈伤诱导培养基上；部分用镊子剥取胚接种到相同培养基上；其余直接接种到MS基本培养基上，待其生长3d时，取其胚轴和胚根(长度均为5mm左右)接种到愈伤诱导培养基上。结果如表1所示。可见，胚的出愈率和胚性愈伤率均优于其他外植体，种子次之，而胚根和胚轴的诱导则很差，因此我们选用成熟胚为多年生黑麦草愈伤组织诱导适宜的外植体。表1两品种不同外植体的愈伤诱导状况愈伤组织的诱导25d更新愈伤诱导培养基一次，统计出愈率，50d统计胚性愈伤率，25℃全黑暗培养。愈伤诱导培养在MS基本培养基的基础上附加30g/L蔗糖和3g/L琼脂，pH＝5.8。分别进行植物激素、水解酪蛋白的单因子梯度实验。①单因子植物激素梯度培养基固定其它成分，添加梯度为2.0、4.0、5.0、6.0、8.0mg/L的2，4-D；固定其它成分，添加梯度为0、0.1、0.2、0.3、0.5mg/L的6-BA。②单因子水解酪蛋白培养基固定其它成分，添加0、0.1、0.3、0.5和1.0g/L水解酪蛋白。品种间、2，4-D各浓度间以及6-BA各浓度间在出愈率上差异显著，且存在交互作用。品种间胚性愈伤率差异显著，而各激素浓度间胚性愈伤率差异不显著。5.0mg/L与6.0mg/L和8.0mg/L差异达到显著水平，6.0mg/L时Ds的出愈率和胚性愈伤率均值最大，其最适宜2，4-D浓度为6.0mg/L；A虽在8.0mg/L时均值最大，但此时方差也较大，6.0mg/L与8.0mg/L2，4-D时A胚性愈伤率均达到最大值，因此认为A适宜2，4-D浓度也为6.0mg/L。0.5mg/L6-BA与其它浓度间差异达到显著水平，0.3mg/L时Ds出愈率均值最大，但胚性愈伤率在0.2mg/L达到最高值后随6-BA浓度升高而降低，因此其适宜6-BA浓度为0.2mg/L；0.2mg/L时A出愈率均值最大，但胚性愈伤率在0.3mg/L时最高，因此其适宜6-BA浓度为0.3mg/L(表2)。表2不同浓度2.4-D、6-BA对两品种愈伤诱导影响随水解酪蛋白浓度的升高，胚性愈伤组织的诱导率呈下降趋势，且各处理出愈率及胚性愈伤率差异均不显著。不含水解酪蛋白时，出愈率最高；水解酪蛋白含量为0.1g/L时，胚性愈伤率最高(表3)。表3水解酪蛋白对爱神特愈伤诱导影响<tablesid="table3"num="003"><tablewidth="709">酸水解酪蛋白含量g/L00.10.30.51.0出愈率％胚性愈伤率％45.58.138.08.740.68.544.37.036.85.6</table></tables>再生培养随机挑取培养90d后的两品种愈伤组织转入按L16(45)正交设计的16种再生培养基中(表4)。光照时间16h/d，温度25℃，30d统计分化指标。而后转入生根培养基中，待根系发达后室温下炼苗3d，清洗后移栽，培养基质草炭∶沙∶土＝1∶1∶1。表4L16(45)正交设计表5显示了正交设计实验的结果，两品种的最高再生率分别达到43.3％和44.4％。再生过程中也形成了少量的白化苗。各因素不同水平对愈伤组织再生率的影响大小分别是A品种，6-BA＞NAA＞Cu2+＞ZT；Ds品种，6-BA＞ZT＞NAA＞Cu2+。两品种最佳的再生培养基激素和Cu2+浓度配比分别为A品种，0.2mg/L6-BA+0.6mg/LNAA+0.5mg/LZT+6.4mg/LCu2+Ds品种，0.1mg/L6-BA+0.4mg/LNAA+0.3mg/LZT+6.4mg/LCu2+(表5)。表5L16(45)结果极差分析表<tablesid="table4"num="004"><tablewidth="654">品种Cultivars处理因子Factors6-BANAAZTCu2+DsX1.1X2.1X3.1X4.1Rj114.7230.8317.724.0416.1119.3925.5820.921.436.1821.2226.3119.4820.296.8319.221.9425.0721.075.87AX1.2X2.2X3.2X4.2Rj220.0910.1327.022716.8920.8416.1928.4718.7412.2821.9619.6424.5218.146.3821.8218.1426.8117.489.32</table></tables>6-BA浓度、NAA浓度对A的再生率影响显著。6-BA浓度间差异达显著水平，6-BA为0.2mg/L时与0.1mg/L和0.3mg/L水平形成极显著差异；NAA为0.6mg/L时与0.4mg/L水平达到显著差异。ZT浓度、Cu2+浓度影响均不显著。6-BA浓度对Ds再生率的影响差异显著。6-BA为0.1mg/L时与0水平形成极显著差异，与0.2mg/L水平形成显著差异；NAA浓度、ZT浓度、Cu2+浓度影响均不显著。妥善管理移栽后再生植株，既有根又有芽的再生苗均可成活。表6L16(45)实验结果实施例2基因枪法将DREB1A基因转入多年生黑麦草中获得转基因植株按照实施例1的方法获得多年生黑麦草尤文图斯胚性愈伤组织和愈伤诱导与分化的适宜培养基。2-3代后，挑取胚性愈伤组织预培养3d，待轰击。将DREB1A基因包被到金粉微弹上，采用美国Biorad公司PDS-1000/He型基因枪，将微弹均匀的涂在载体膜上，微弹的飞行距离为6cm，每皿轰击两次。轰击后在含有渗透剂的培养基上过夜。次日通过gusA组织化学染色观察基因的瞬时表达状况，并将愈伤组织转入诱导培养基中黑暗条件下恢复培养10d，使转入的基因能够充分的表达。而后将其转入含有筛选剂(潮霉素50mg/L)的诱导培养基中培养30d，选择存活材料转入含有筛选剂的再生培养基中，30d后将再生出小苗的愈伤转入不含筛选剂的再生培养基中，同时通过gusA化学组织染色观察基因的稳定表达。将长到3-4片叶的小苗转入生根培养基中生根，根系发达后，室温下炼苗3d后移入花盆中。提取抗性植株DNA进行PCR检测，取PCR阳性植株的DNA进行Southern印迹杂交鉴定，以目的基因的PCR产物做探针。共检测尤抗性植株12株，其中阳性植株10株，转化效率83％。权利要求1.一种建立多年生黑麦草高频再生体系的方法，其技术体系包括(1)外植体的消毒；(2)外植体的筛选；(3)胚性愈伤组织的诱导；(4)愈伤组织的再分化；(5)再生苗的生根；(6)再生植株的移栽。2.按照权利要求1所述一种建立多年生黑麦草高频再生体系的方法，其特征在于，它是一种应用于多年生黑麦草的组织培养技术。3.按照权利要求1所述一种建立多年生黑麦草高频再生体系的方法，其特征在于，种子的消毒剂选用次氯酸钠加一滴Tween-20，消毒方式为磁力搅拌器搅拌，时间为35-40min，无菌水清洗6次以上，4℃低温浸泡10-12h，再次清洗后使用。4.按照权利要求1所述一种建立多年生黑麦草高频再生体系的方法，其特征在于，考察了四种外植体，确定成熟胚为最佳外植体。5.按照权利要求1所述一种建立多年生黑麦草高频再生体系的方法，其特征在于，愈伤诱导培养基是指MS+4-6mg/L2，4-D+0.2-0.3mg/L6-BA+0.1g/L水解酪蛋白；分化培养基是指MS+0.1-0.2mg/L6-BA+0.4-0.6mg/LNAA+0.3-0.5mg/LZT+6.4mg/LCu2+；生根培养基是指MS+0.4mg/LNAA+0.1mg/LZT。全文摘要本发明一种建立多年生黑麦草高频再生体系的方法，是为遗传转化工作提供良好的受体材料。主要步骤包括种子的消毒，以成熟胚为外植体在愈伤诱导培养基上诱导胚性愈伤组织，继代培养后转入再生培养基中分化出再生小苗，而后转入生根培养基中壮苗生根，获得完整植株后移栽。本发明选用了取材简便且不受季节限制的最佳外植体，消毒方式安全有效。通过调控愈伤诱导、分化和生根培养基中各激素和添加物的浓度，有效提高了胚性愈伤诱导率，且在继代培养过程中始终保持愈伤的胚性结构；再生率和生根率很高，移栽成活率为100％。文档编号C12N5/04GK1732758SQ20051008547公开日2006年2月15日申请日期2005年7月21日优先权日2005年7月21日发明者韩烈保,李雪,曾会明,信金娜,刘君申请人:北京林业大学,韩烈保,李雪