专利名称：孝顺竹高效稳定再生体系建立的方法
技术领域：
本发明涉及林木生物技术和组织培养领域，特别涉及到孝顺竹(Bambusa multiplex)高效稳定再生体系的建立。发明目的竹类植物生长快、产量高、再生能力强、具有一次种植，可永续利用的特点，是我国 重要的森林资源。竹子自古以来就在我国人民生活中扮演着重要角色，而现今除了传统的 竹笋食品、竹工艺品外，大量高品质、高性能的新型竹子工业品已被研制和生产，如竹地 板、竹车厢板、竹制模板、竹纤维纸制品、竹纤维纺织品等，竹产业已成为我国南方山区发展 和致富的新兴产业，据统计2005年我国竹产业产值已达600多亿元，在目前我国森林覆盖 率低，木材严重缺乏的情况下，竹材以竹代木不仅具有重要的生态价值，而且具有重要的经 济价值。随着目前竹材工业利用的不断深入，农民不仅需要产量更高的竹种，市场更需要 材性更好的竹种，以满足不同产品的生产要求，因此竹子的遗传改良日益受到重视。长期以来由于竹类植物特殊的开花生物学特性，导致竹子的常规育种，如杂交等 研究进展相对于农作物而言十分缓慢而且困难。相对传统育种而言，目前现代生物技术育 种迅速发展，具有创造变异多、育种目的性强、时间短、后代选择容易等优点，已在农作物育 种方面取得大量成功。因此，采用现代生物技术育种如基因导入与移植等应该是实现竹类 植物遗传改良育种的有效途径。由于基因的导入与移植必须建立在愈伤组织培养和再生体 系构建的基础之上，而竹类植物是目前公认的最难建立再生体系的植物，因此成熟的由竹 愈伤组织诱导的再生体系的构建一直是制约竹类植物生物技术育种研究的瓶颈。本发明提供了孝顺竹(Bambusa multiplex)高效稳定再生体系建立的方法，将为 孝顺竹乃至丛生竹生物技术育种，如基因导入与移植等提供技术平台。
背景技术：
近几十年来，随着国际上植物生物技术的快速发展，国内外对竹子生物技术研究 也逐渐增加，目前国际上和本专利有关的由竹愈伤组织诱导的再生体系构建方面的报道主 要有1982年Metha等报道了印度刺竹(Bambusa arundinacea)种子成熟胚诱导出愈伤 组织和再生植株(参考文献1)。1983 年 Huang 和 Murashige 从刚竹属(Phyllostachy)、箬竹属(Sasa)、刺竹属 (Bambusa)的叶片和嫩茎尖诱导出愈伤组织(参考文献2)。1985年Rao等以牡竹(D. strictus)成熟种子诱导了愈伤组织，进而再生植株(参 考文献3)。1986 年 Yeh 和 Chang 用绿竹(B. οldhamii)、吊丝球竹(B. beecheyana)的花序以 体细胞胚胎发生方式再生植株(参考文献4、5)。1989年Huang等报道了用绿竹(B. ο ldhamii)、罗汉竹(Ph. aurea)和箬竹(S. pygmaea)的嫩茎尖进行愈伤组织诱导，仅由BA和NAA诱导的愈伤组织可器官发生，形成再生植株(参考文献6)。1990年Tsay报道了 Sinocalamus Iatiflora的花药组织培养，形成了愈伤组织和 再生植株(参考文献7)。2007年Gillis等利用巴苦竹(Bambusa balcooa)小穗诱导出愈伤组织并建立了 高效再生体系(参考文献8)。我国大陆学者在竹子生物技术方面的研究起步较晚。90年代结合推广优良品种(杂种)，张光楚等报导了麻竹(S. Iatiflorus munro)、 M tt (B. oldhamii)> 杂禾中 g 7 号(Bambusapervariabi1i sMcClure X Dendrocalamu s IatiflorusMunroNo. 7)、花吊丝竹(Dendrocalamus minorvar. amoenus)、马来舌甘龙竹 (Dendrocalamus asper)等竹种的组织培养快速竹苗繁殖技术，但是需要说明的是张光楚 等报导的组培不是经愈伤组织诱导而再生的竹株，而是未经“脱分化”过程而直接产生丛生 芽，再由丛生芽形成植株，这种竹子扩繁技术基本属于促进节芽萌生的微繁殖体系(参考 文献9-11)。1991年阙国宁等报导了对黄竹(D. membranceus)禾Π印度刺竹(Bambusa arundinacea)的培养(参考文献12-13)，2007年吴涛等报导了对金丝慈竹(Bambusa affinis ‘viridiflavus’)的培养(参考文献14)，均属经愈伤组织再生竹株的研究，但其 外植体均为茎段，并且上述研究均未涉及孝顺竹(Bambusa multiplex)。目前涉及孝顺竹(Bambusa multiplex)组织培养研究的报导主要有顾小平等 (2006年)、吴益民等(2000年)、梁建群等(1996年)、Huang et al (1993年)，见参考文献 15-18。这些文献报导了采用孝顺竹竹笋或小穗等作为外植体诱导出愈伤组织，但并未实现 植株再生。主要参考文献1. Metha. U,IVR Rao and HY Mohan Ram. Somatic embryogensis in bamboo[C]. In Proceeding 5th Interenational Cogress of Plant tissue culture & cell Culture, 1982，109 1102. L. C. Huang, T. Murashige. Tissue culture investigations of bamboo I. Callus cultures of Bambusa,Phyllostachys and Sasa[J]. Bot Bull Acad Sin,1983, 24，31 523. Rao. IU,IVR Rao and V Narang. Somatic embryogenesis and regeneration of plants in the bamboo Dendrocalamus strictus[J]· Plant Cell Reports, 1985,4 :191 1944. Yeh, ML and WC Chang. Somatic embryogenesis and subsequent plant regeneration from inflorescence of Bambusa beecheyana Munro var.beecheyana[J]. Plant Cell Reports，1986，5 :409 4115. Yeh,ML and WC Chang. Plant regeneration through somatic embryogenesis in callus culture of green bamboo(Bambusa oldhamii Munro)[J]. Theoretical and Applied Genetics，1986，73 :161 1636. L. C. Huang, B. L. Huang and W. L. Chen. Tissue culture investigations ofbamboo IV.Organogenesis leading to adventitious shoots and plants in excised shoot apices[J]. Environ Exp Bot，1989，29，307 3157.Tsay. HS. cc Yeh and JY Hsu. Embryogenesis and plant regeneration from anther culure of bamboo[Sinocalamus latiflora(Munro)McClure] [J].Plant cell Reports,1990，9 349 3518.Koen Gillis，Johan Gielis，Hilde Peeters et al. Somatic embryogenesis from mature Bambusa balcooa Roxburgh as basis for mass production of elite forestry bamboos[J]. Plant Cell, Tissue and Organ Culture,2007(91) 115 ~ 1239.张光楚，王裕霞.麻竹离体快速繁殖技术的研究[J].竹子研究汇刊，1993， 12(4) 7 1510.张光楚，王裕霞.杂种撑麻7号竹的组织培养研究[J].林业科学研究，2003， 16(3) 245 53111.张光楚，王裕霞，谭源杰等.丛生竹的组培快繁技术[J].竹子研究汇刊，2004， 23(1) 13 2012.阙国宁，诸葛强.竹子愈伤组织培养与植株再生[J].竹子研究汇刊，1991， 10(4) 413.阙国宁，诸葛强.黄竹细胞悬浮培养和原生质体分离[J].林业科学研究， 1994，7(1) 44 4714.吴涛，卢娟娟，丁雨龙等.金丝慈竹愈伤组织培养及植株再生研究[J].林业科 技开发，2008，22 (2) 19 2215.顾小平，苏梦云，岳晋军等.几种丛生竹愈伤组织诱导与防褐变技术研究.林 业科学研究，2006，19(1) 75-7816.吴益民，边红武，王君晖等.竹子悬浮细胞系的建立和组织培养试管苗移栽观 察.竹子研究汇刊，2000，19(1) 52-5617.梁群健.绿竹、麻竹和蓬莱竹的组织培养.国立台湾大学硕士论文.199618. Huang L C,Huang B L. Bamboo tissue culture :Recent Advances in Botany. Institute of Botany, Academia Sinica Monograph Series,1993, (13) :203_212本发明的特点纵观国内外研究现状，虽然目前已在多种竹种上实现了以不同细胞诱导的愈伤组 织和再生植株，但对孝顺竹的研究仅报导了愈伤组织诱导，并未实现植株再生。而且上述研 究均存在褐变严重、再生频率不高以及重复困难等问题，当我们将前人的研究方法直接用 于孝顺竹愈伤组织培养和再生体系构建时也未获成功，说明不同竹种之间愈伤组织培养和 再生体系构建方法存在一些差异。经过大量研究和试验，并对同类研究方法进行了大量改 良和革新，发明人探索出一套孝顺竹愈伤组织培养和再生体系构建方法，成功的实现了孝 顺竹种胚的愈伤组织诱导和植株再生。
发明内容
孝顺竹(Bambusa multiplex)高效稳定再生体系建立的方法，其特征包括外植体消毒、愈伤组织诱导与增殖、愈伤组织分化与生根、以及壮苗移栽过程，具体步骤如下
(1)外植体消毒选择健康饱满的种实先用75% (ν/ν)乙醇处理1分钟；再用 0. 1% (w/v)升汞(每升加5-6滴吐温-80)浸泡15分钟；然后用无菌水冲洗数次；最后用 无菌纸吸干种实表面水分后待接种。(2)愈伤组织诱导与增殖将消毒后的外植体接种到愈伤组织诱导培养基上暗 培养3-14天使愈伤组织形成；然后将色泽淡黄致密的愈伤组织分离出来接种到继代增 殖培养基上暗培养14-21天。所述诱导与增殖培养基是以NB培养基为基础，添加2， 4-D(2-10mg/L)、卡拉胶(8-lOg/L)、脯氨酸(400-600mg/L)、谷氨酰胺(400-600mg/L)、水解 酪蛋白(200-400mg/L)。(3)愈伤组织分化与生根将继代增殖培养后的愈伤组织接种到预分化培养基上 培养3-7天；然后转到分化培养基上培养10-30天；待愈伤组织产生0. 1-1. 5cm丛芽后将 丛芽切割下来接种到生根培养基上，7-15天后丛芽生根。光照时间12小时/日，光照强度 800-20001UX。所述预分化培养基是以MS培养基为基础，添加KT(2_5mg/L)、6-BA(2_5mg/ L)、卡拉胶(8-10g/L)。分化培养基是以MS培养基为基础，添加卡拉胶(8-10g/L)。生根培 养基以MS培养基为基础，添加NAA(l-5mg/L)、卡拉胶(8-10g/L)。(4)壮苗与移栽将生根的再生竹株移栽到壮苗培养基中培养7-15天；开瓶炼苗 2-3天；取出小苗清洗根部培养基；再用低浓度高锰酸钾溶液清洗根部；然后将小苗栽植到 灭菌的介质中，遮阴散射光培养一个月后多数幼苗成活。所述的壮苗培养基是以MS培养基 为基础，添加 NAA (2-5mg/L)、BA (2_5mg/L)、卡拉胶(8-lOg/L)。
具体实施例方式下面结合孝顺竹(Bambusa multiplex)实施例对本发明进行详细说明。(1)挑选饱满健康种实，先用75% (ν/ν)乙醇处理1分钟，再用0. 1% (w/v)升汞 (每升56滴吐温-80)浸泡15分钟，然后用无菌水冲洗4次，再用无菌纸吸干种实表面水分 后待接种。(2)愈伤组织诱导与增殖将消毒后的外植体接种到愈伤组织诱导培养基上暗培 养7天使愈伤组织形成；然后将色泽淡黄致密的愈伤组织分离出来，接种到继代增殖培养 基上暗培养18天。所述诱导与增殖培养基是以NB培养基为基础，添加2，4-D(4mg/L)、卡 拉胶(8g/L)、脯氨酸(500mg/L)、谷氨酰胺(500mg/L)、水解酪蛋白(300mg/L)。(3)愈伤组织分化与生根将继代增殖培养后的愈伤组织接种到预分化培养基 上培养7天；然后转到分化培养基上培养15天；待愈伤组织产生0. 1-1. 5cm丛芽后将丛 芽切割下来接种到生根培养基上，7-15天后丛芽生根。光照时间12小时/日，光照强度 800-20001UX。所述预分化培养基是以MS培养基为基础，添加KT(3mg/L)、6_BA(3mg/L)、卡 拉胶(10g/L)。分化培养基是以MS培养基为基础，添加卡拉胶(10g/L)。生根培养基以MS 培养基为基础，添加NAA(2mg/L)、卡拉胶(10g/L)。(4)壮苗与移栽将生根的再生竹株移栽到壮苗培养基中培养7-15天；开瓶炼苗 2-3天；取出小苗清洗根部培养基；再用低浓度高锰酸钾溶液清洗根部；然后将小苗栽植到 灭菌的介质中(山地黄壤土 蛭石泥炭土 = 1:1: 1)，遮阴散射光培养一个月后多数 幼苗成活。所述的壮苗培养基是以MS培养基为基础，添加NAA(3mg/L)、BA(3mg/L)、卡拉胶 (10g/L)。
权利要求
孝顺竹(Bambusa multiplex)高效稳定再生体系建立的方法，其特征包括外植体消毒、愈伤组织诱导与增殖、愈伤组织分化与生根、以及壮苗移栽过程，具体步骤如下(1)外植体消毒选择健康饱满的种实先用75％(v/v)乙醇处理1分钟；再用0.1％(w/v)升汞(每升加5-6滴吐温-80)浸泡15分钟；然后用无菌水冲洗数次；最后用无菌纸吸干种实表面水分后待接种。(2)愈伤组织诱导与增殖将消毒后的外植体接种到愈伤组织诱导培养基上暗培养3-14天使愈伤组织形成；然后将色泽淡黄致密的愈伤组织分离出来接种到继代增殖培养基上暗培养14-21天。所述诱导与增殖培养基是以NB培养基为基础，添加2，4-D(2-10mg/L)、卡拉胶(8-10g/L)、脯氨酸(400-600mg/L)、谷氨酰胺(400-600mg/L)、水解酪蛋白(200-400mg/L)。(3)愈伤组织分化与生根将继代增殖培养后的愈伤组织接种到预分化培养基上培养3-7天；然后转到分化培养基上培养10-30天；待愈伤组织产生0.1-1.5cm丛芽后将丛芽切割下来接种到生根培养基上，7-15天后丛芽生根。光照时间12小时/日，光照强度800-2000lux。所述预分化培养基是以MS培养基为基础，添加KT(2-5mg/L)、6-BA(2-5mg/L)、卡拉胶(8-10g/L)。分化培养基是以MS培养基为基础，添加卡拉胶(8-10g/L)。生根培养基以MS培养基为基础，添加NAA(1-5mg/L)、卡拉胶(8-10g/L)。(4)壮苗与移栽将生根的再生竹株移栽到壮苗培养基中培养7-15天；开瓶炼苗2-3天；取出小苗清洗根部培养基；再用低浓度高锰酸钾溶液清洗根部；然后将小苗栽植到灭菌的介质中，遮阴散射光培养一个月后多数幼苗成活。所述的壮苗培养基是以MS培养基为基础，添加NAA(2-5mg/L)、BA(2-5mg/L)、卡拉胶(8-10g/L)。
全文摘要
孝顺竹高效稳定再生体系建立的方法，其特征包括外植体消毒、愈伤组织诱导与增殖、愈伤组织分化与生根、以及壮苗移栽过程。本发明解决了孝顺竹(Bambusa multiplex)通过愈伤组织再生植株的困难问题，将为丛生竹生物技术育种提供技术平台。本发明涉及林木生物技术和组织培养领域，特别涉及孝顺竹高效稳定再生体系的建立。
文档编号A01G31/00GK101822212SQ20091009629
公开日2010年9月8日 申请日期2009年3月5日 优先权日2009年3月5日
发明者岳晋军, 袁金玲, 顾小平 申请人:顾小平;袁金玲;岳晋军