专利名称：一种建立海滨锦葵再生体系的方法
技术领域：
本发明涉及通过组织培养技术的植物再生，尤其涉及利用海滨锦葵成熟胚建立再生体系的方法。
背景技术：
海滨锦葵(Kostelezkya virginica L.Presl.)是近年来我国从国外引进的耐盐植物之一(尹增芳等，植物资源与环境学报，2006，15(1)14-17)，原产于美国东部沿海的含盐沼泽地带，其生长基质含盐量可高达2.5％，是适宜海滨滩涂地带生长的多年生草本植物。海滨锦葵种子富含脂肪和蛋白质，种子油可以作为动力燃料使用，是重要的生物柴油用植物资源之一(尹金来等，江苏农业科学，2000(6)29-31；阮成江，大连民族学院学报，2006(1)13-16)；海滨锦葵更新周期一般是8～10个月，这一特点决定它的种植不需要太多的劳动投入，因此非常有利于在人少地多的滩涂地带进行大面积种植；此外，海滨锦葵为无限花序，花期长，花形呈小喇叭状，深粉红色，大面积种植可以美化滩涂的自然景观，对发展沿海旅游业也颇有益处(尹金来等，江苏农业科学，2000(6)29-31)。因此，海滨锦葵的引入与栽培为改良我国沿海滩涂、发展盐土农业以及开发“生物柴油”新能源开辟了广阔前景。
然而，海滨锦葵种子发芽率低，直播育苗会出现较为严重的空苗或缺苗现象，导致在实际栽培中对种子的需求量大，浪费严重。这严重地限制了海滨锦葵的大面积栽培。
为了在短时间内大面积地推广种植海滨锦葵，建立遗传性状稳定的快速繁殖体系是非常必要的。以植物组织培养技术为基础的快速繁殖技术可以有效的解决上述问题。通过植物组织培养技术进行植株再生，能有效地保存亲本的优良遗传性状，成苗快且均一。此外，组织培养是现代生物技术不可缺少的组成部分，以组织培养技术为基础建立高效的海滨锦葵再生体系是进一步应用转基因技术进行遗传性状改良的重要前提。
Deborah等在1989年试图利用海滨锦葵茎段及成熟胚建立组织培养及再生体系，但仅在茎段诱导的愈伤组织中得到了组培苗，对于成熟胚的组织培养及再生一直没有成功。(Deborah A Cook等，植物细胞、组织及器官培养(Plant CellTissue and Organ Culture)，1989，17111-119)。本研究小组按照Deborah等提供的方法进行试验，但并没有按照报道的结果从茎段诱导的愈伤组织中得到组培苗。
发明内容
本发明以海滨锦葵成熟胚为外植体进行离体培养，诱导外植体形成愈伤组织，并使愈伤组织出芽和生根，以高频、稳定地实现植株再生，并为遗传转化提供良好的受体材料。
本发明的目的是通过如下的技术方案来实现的以海滨锦葵成熟胚为外植体，进行包括愈伤组织诱导、不定芽诱导及生根培养的离体培养，进而建立海滨锦葵再生体系的方法，该方法包括以下具体步骤(1)外植体的获得及表面消毒；(2)在含有激素的MS基础培养基上进行愈伤组织诱导，所述的激素是浓度为0.5～2.0mg/L的2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-dichlorophenoxyacetic acid，2，4-D)；(3)在含有激素的1/2MS基础培养基上进行愈伤组织的继代培养，所述的激素是浓度为0.3mg/L的吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)与浓度为0.3mg/L的玉米素(zeatin，ZT)的组合；(4)不定芽的诱导，所使用的培养基包括基础培养基和激素，所述的基础培养基是MS基础培养基或1/2MS基础培养基，所述的激素是浓度为0.1～0.2mg/L吲哚乙酸与浓度为0.3～0.5mg/L的玉米素的组合；(5)生根培养，使用不含激素的MS基础培养基；(6)无菌苗的移栽及炼苗。
上述步骤(2)、(3)、(4)、(5)中所使用的培养基中还均含有浓度为30g/L的蔗糖和浓度为8g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。
本发明所述的建立海滨锦葵再生体系的方法中，步骤(2)，即愈伤组织的诱导中所使用的激素2，4-二氯苯氧基乙酸的优选浓度为0.5mg/L。
步骤(4)，即不定芽的诱导中，优选基础培养基为1/2MS基础培养基；优选的激素组合是浓度为0.1mg/L的吲哚乙酸与浓度为0.5mg/L的玉米素。
本发明所述的建立海滨锦葵再生体系的方法中，愈伤组织的诱导，即上述步骤(2)包括两个阶段a)暗诱导阶段，该阶段自接种后起，持续72小时；b)半光培养阶段，光照周期为14h/day，光照强度为2500lx，该阶段紧接上述暗诱导阶段，持续2周；所述步骤(2)，即愈伤组织的诱导阶段的培养条件还包括温度26±2℃，相对湿度70％～80％。
本发明以海滨锦葵成熟胚为外植体进行离体培养，成功构建海滨锦葵的再生体系，愈伤组织诱导率、不定芽诱导率、生根率最高分别达到86.8％、64.2％和95.2％，再生苗存活率达到80％，为我国海滨锦葵的大面积栽培提供了育苗的技术基础。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但这不限制本发明的范围。
实施例1以海滨锦葵成熟胚为外植体进行离体培养，建立海滨锦葵再生体系的方法，主要包括外植体的获得、愈伤组织诱导、愈伤组织继代培养、不定芽的诱导、根的诱导及无菌苗的移栽与炼苗，具体步骤为1.作为外植体的海滨锦葵成熟胚的获得及表面消毒(1)取成熟的海滨锦葵种子若干颗，以浓硫酸浸泡处理1h，使种皮变软；(2)以双蒸水冲洗浓硫酸浸泡处理后的海滨锦葵种子5次以上，用镊子和手术刀小心剥去种子外皮出现完整的种胚；(3)切除子叶和胚根，留下胚轴部分作为外植体；(4)外植体的表面消毒将上述作为外植体的胚轴浸没于75％乙醇10s，然后用双蒸水冲洗干净。
2.愈伤组织的诱导将上述经表面消毒后的外植体接种到愈伤组织诱导培养基上，该培养基为含有0.5mg/L 2，4-D，30g/L蔗糖及8g/L琼脂的MS基础培养基，该培养基pH值为5.8；接种后转入培养室进行培养，培养室温度为26±2℃，相对湿度70％～80％；诱导的第一阶段为暗培养，该阶段从外植体接种完成开始，持续72小时；诱导的第二阶段为半光培养，该阶段光照周期为14h/day，光照强度为2500lx，持续2周；愈伤组织的诱导率为86.8％。
3.愈伤组织的继代培养将步骤2中诱导出的愈伤组织转入继代培养基，该培养基为含有0.3mg/LIAA、0.3mg/L ZT、30g/L蔗糖及8g/L琼脂的1/2MS基础培养基，该培养基pH值为5.8，愈伤组织继代培养条件与愈伤组织诱导第二阶段培养条件相同。愈伤组织经过继代培养后，愈伤块明显增大。
4.不定芽的诱导将经过继代培养后的愈伤组织转入不定芽诱导培养基，该培养基为含有0.1mg/L IAA、0.5mg/L ZT、30g/L蔗糖及8g/L琼脂的1/2MS基础培养基，该培养基pH值为5.8，不定芽诱导培养条件与继代培养条件相同，诱导2周后，出芽率为64.2％。
5.生根培养将上述步骤4中产生了不定芽的愈伤组织转入生根培养基，该培养基为含有30g/L蔗糖及8g/L琼脂的MS基础培养基，该培养基pH值为5.8，生根培养条件与继代培养条件相同，2周后，生根率为95.2％。
6.将经过上述步骤产生的无菌苗的移栽、炼苗，最后成苗率为80％。
实施例2本实施例所述的以海滨锦葵成熟胚为外植体进行离体培养从而建立海滨锦葵再生体系的方法，具体操作步骤与实施例1相同，但步骤2中所使用的愈伤组织诱导培养基是含有1.0mg/L 2，4-D、30g/L蔗糖及8g/L琼脂的MS基础培养基，愈伤组织的诱导率为75％。
实施例3本实施例所述的以海滨锦葵成熟胚为外植体进行离体培养从而建立海滨锦葵再生体系的方法，具体操作步骤与实施例1相同，但步骤2中所使用的愈伤组织诱导培养基是含有1.5mg/L 2，4-D、30g/L蔗糖及8g/L琼脂的MS基础培养基，愈伤组织的诱导率为86.8％。
实施例4本实施例所述的以海滨锦葵成熟胚为外植体进行离体培养从而建立海滨锦葵再生体系的方法，具体操作步骤与实施例1相同，但步骤2中所使用的愈伤组织诱导培养基是含有2.0mg/L 2，4-D、30g/L蔗糖及8g/L琼脂的MS基础培养基，愈伤组织的诱导率为81.8％。
实施例5本实施例所述的以海滨锦葵成熟胚为外植体进行离体培养从而建立海滨锦葵再生体系的方法，具体操作步骤与实施例1相同，但步骤4中所使用的不定芽诱导培养基为含有0.1mg/L IAA、0.3mg/L ZT、30g/L蔗糖及8g/L琼脂的MS基础培养基，不定芽的出芽率为45.9％。
实施例6本实施例所述的以海滨锦葵成熟胚为外植体进行离体培养从而建立海滨锦葵再生体系的方法，具体操作步骤与实施例1相同，但步骤4中所使用的不定芽诱导培养基为含有0.1mg/L IAA、0.5mg/L ZT、30g/L蔗糖及8g/L琼脂的MS基础培养基，不定芽的出芽率为62.1％。
实施例7本实施例所述的以海滨锦葵成熟胚为外植体进行离体培养从而建立海滨锦葵再生体系的方法，具体操作步骤与实施例1相同，但步骤4中所使用的不定芽诱导培养基为含有0.2mg/L IAA、0.5mg/L ZT、30g/L蔗糖及8g/L琼脂的MS基础培养基，不定芽的出芽率为53.8％。
权利要求
1.一种建立海滨锦葵再生体系的方法，其特征在于以海滨锦葵成熟胚为外植体进行离体培养，该方法包括以下具体步骤(1)外植体的获得及表面消毒；(2)在含有激素的MS基础培养基上进行愈伤组织诱导，所述的激素是浓度为0.5～2.0mg/L的2，4-二氯苯氧基乙酸；(3)在含有激素的1/2MS基础培养基上进行愈伤组织的继代培养，所述的激素是浓度为0.3mg/L的吲哚乙酸与浓度为0.3mg/L的玉米素的组合；(4)不定芽的诱导，所使用的培养基包括基础培养基和激素，所述的基础培养基是MS基础培养基或1/2MS基础培养基，所述的激素是浓度为0.1～0.2mg/L吲哚乙酸与浓度为0.3～0.5mg/L的玉米素的组合；(5)生根培养，使用不含激素的MS基础培养基；(6)无菌苗的移栽及炼苗，上述步骤(2)、(3)、(4)、(5)中所使用的培养基中还均含有浓度为30g/L的蔗糖和浓度为8g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤(2)中所使用的激素是浓度为0.5mg/L的2，4-二氯苯氧基乙酸。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤(4)中所使用的基础培养基是1/2MS基础培养基。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤(4)中所使用的激素是浓度为0.1mg/L的吲哚乙酸与浓度为0.5mg/L的玉米素的组合。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)的愈伤组织诱导包括2个阶段a)暗诱导阶段，该阶段自接种后起，持续72小时；b)半光培养阶段，光照周期为14h/day，光照强度为2500lx，该阶段紧接上述暗诱导阶段，持续2周；所述步骤(2)的培养条件还包括温度26±2℃，相对湿度70％～80％。
全文摘要
本发明公开了一种建立海滨锦葵再生体系的方法，该方法以海滨锦葵成熟胚为外植体，经过如下步骤获得海滨锦葵再生植株(1)外植体表面消毒，(2)愈伤组织诱导，(3)愈伤组织继代培养，(4)不定芽诱导，(5)生根培养，(6)无菌苗移栽和炼苗；步骤(2)使用含有0.5～2.0mg/L2，4－二氯苯氧基乙酸的MS基础培养基，步骤(3)使用含有0.3mg/L吲哚乙酸和0.3mg/L玉米素的1/2MS基础培养基，步骤(4)使用含有0.1～0.2mg/L吲哚乙酸和0.3～0.5mg/L玉米素的MS或1/2MS基础培养基，步骤(5)使用不含激素的MS基础培养基。使用本发明的方法，可以海滨锦葵成熟胚为外植体构建再生体系，获得海滨锦葵再生植株，其中愈伤组织诱导率、不定芽诱导率、生根率最高分别达到86.8％、64.2％和95.2％，再生苗存活率达到80％。
文档编号C12N5/04GK1883258SQ20061004717
公开日2006年12月27日 申请日期2006年7月7日 优先权日2006年7月7日
发明者阮成江, 金华, 郑熙, 单莹 申请人:大连民族学院