专利名称：一种固定化酶制备人参抗癌有效成份的方法
技术领域：
本发明涉及由固定化工业酶制剂转化人参二醇组皂苷制备C-K的方法，特别是涉及工业酶制剂为β-葡聚糖苷酶，纤维素酶，纤维二糖酶；所用的固定化方法为海藻酸钙法。
背景技术：
固定化技术是指通过化学或物理的手段将游离细胞或酶定位于限定的空间区域内，使其保持活性、作用时间长、不易流失、抗毒和耐受力明显增加，而且固液分离容易，并可反复利用。其开始于1916年Nelson和Griffin发现蔗糖酶吸附在骨碳微粒上仍保持与游离酶同样的活性，之后，人们不断研究各种酶固定化技术和方法，先后实现了对过氧化氢酶等的固定化。1969年日本的千烟一郎实现了固定化酰化氨基水解酶生产L-氨基酸，成功实现了固定化酶工业应用。20世纪70年代初期我国开始研究固定化生物催化剂技术，并取得了一些可喜的成就[7]。现在固定化技术已经广泛应用于食品、酿酒、化工、环境工程、医药等各个领域，但利用固定化酶技术使人参属植物中的根、茎、叶总皂苷中含量较高的前体物质人参二醇组皂苷转变为抗肿瘤活性成份-C-K的研究尚未见文献报导。
研究表明C-K无论在体内、体外均具有良好的抑制癌细胞生长作用和抗转移作用，无论对实体或流体癌细胞株均有显著效果，如抗浸润和转移作用，利用多种体内外转移模型如路易斯肺癌细胞LLC、人纤维肉瘤HT1080、小鼠黑色素瘤B16细胞的易转移亚型B16-F10细胞等研究C-K对肿瘤细胞浸润和转移的影响，结果发现C-K虽不直接抑制肿瘤块形成，但具有明显的抗转移作用；诱导肿瘤细胞凋亡作用，C-K在与B16-BL6和LLC两种肿瘤细胞共同孵育时，15min后即出现在肿瘤细胞的核内，24h之内诱导出现形态学上的细胞凋亡表现；抗肿瘤血管新生作用，研究表明无毒剂量的C-K即可抑制CM-L5所致的HSE细胞的增殖和管腔形成活性，并对肿瘤诱导的心血管形成产生抑制[28]；抗致突变和预防癌变作用，C-K有抗苯并芘诱导的致突变作用，其作用具备药理学的量效关系。此外，C-K还可降低苯并芘引起中国仓鼠肺纤维母细胞(Chinesehamster lungfibmbl～tcells CHL)的染色体畸变，说明C-K可以作为突变预防剂。
人参次生稀有皂苷-Rg3、-Rh2和C-K具有显著的抗肿瘤活性，但作为人参、西洋参、三七等发挥药效活性的物质基础，它们在天然植物中的含量极低。例如-Rg3在白参中的含量仅为0.0003％，在红参中的含量约为0.03％；而-Rh2在红参中含量仅为0.001％，人参茎叶中的-Rh2含量较红参高10倍，西洋参茎叶中分离得到-Rh2含量为0.001％-0.0043％。C-K在未加工的人参中并不存在，为人参皂苷的微生物代谢产物，在三七中的含量仅为0.032％。因此，如何提高这些微量次生活性皂苷的含量，是目前天然药物领域中的研究热点。
而就天然植物资源来说，某种植物中除少数活性成份外，大部分都是低活性成份，但这些成份往往都是生源关系相近或者结构类似。以人参中的单体皂苷为例，如-Rb、-Re、-Rg、-Rh，它们分子结构的母核是相同的，都是相对稳定的达玛烷型四环三萜皂苷，不同的是它们在母核的特定位置上连接糖的种类、数量或连接位置不同，因此，它们所具有的抗癌作用强度也不同。-Rb1、-Rb2、-Rc、-Rd和-Re等由于支链上连接的糖较多，分子量大，抗癌活性不高；而-Rg3、-Rh2和-Rh1等，支链上连接较少的葡萄糖，但却被证实具有较高的抗癌作用。因此，只要能把分子量较大的低活性皂苷支链上的糖减少或者去掉，都能得到预期的高活性皂苷。
目前常用的水解皂苷的方法有酸水解法、碱水解法和生物转化法。研究发现皂苷的水解方式有两种，一种是皂苷一次完全水解，生成苷元和糖，另一种是皂苷分步水解，即部分糖先被水解，或双皂苷中先水解一条糖链形成次生苷或前皂苷元。
虽然这两种方法都可以使皂苷水解，但是它们的水解条件都十分剧烈，不易控制，而且由于在水解过程中能使皂苷元发生脱水、环合、双键位移、取代基位移、构型转化等变化，使水解的副产物增多，目标产物很难得到或含量较低。更重要的是这两种方法从原料到反应过程均向环境中排放了大量的有机溶剂、酸和碱等污染物，对环境造成很大程度上的危害；而且酸和碱对操作人员本身也会造成伤害，所以需要寻找新的转化技术和方法，即能更有效的将低活性、高含量的植物皂苷转化成高活性、天然含量低的单体皂苷，又能做到不给环境造成负担，这是合理利用天然药物资源、实行清洁生产、使中药走向世界，建立绿色中药产业的可行之路。
在最近发展起来的各种新技术中，尤以生物转化技术最为引人注目。生物转化(Biotransformation或Bioconversion)是利用生物体系将加入到反应系统中的外源有机底物某一特定部位或功能基团进行特异性的结构修饰以获得有价值的不同化学产物的工艺。这里的生物转化强调的是外源底物与产物之间通过一步反应完成，其实质是一种酶的催化反应。由于植物细胞内含有催化氧化、还原、羟基化、乙酰化、酯化、葡萄糖基化、异构化、甲基化、去甲基化、环氧化等反应的酶类，因此它们具有将外源底物转化成活性物质的能力。生物转化的区域和立体选择性强、反应条件温和、操作简便、成本较低、公害少，且能完成一些化学合成难以进行的反应，受到有机化学家、药物化学家和微生物学家们的极大重视。生物转化的范围很广，几乎包括各种类型的化学反应，如水解、缩合、酰基转移、氧化还原等等。因此利用生物对植物皂苷进行转化既克服了传统酸、碱水解方法的缺陷，又减少了污染物的产生，符合从末端治理向源头控制转化的新型现代生产模式，因而越来越受到重视，生物转化法已成为当前的研究热点。
发明内容为了简单、方便、低成本、大批量的制备C-K，本发明提供了一种固定化工业酶制剂转化(水解)人参二醇组皂苷制备C-K的方法，二醇型人参皂苷与固定化工业酶制剂重量比为1∶9-9∶1，pH值在5.0-7.0之间，水解温度30-45℃，水解时间2h-15d。
本发明用固定化酶水解人参皂苷制备C-K的方法中，收集过程是反应产物去除固定化酶后注入到D101大孔吸附树脂柱内，用水冲洗至无色，再用70-85％乙醇冲洗树脂柱。将洗脱液浓缩，挥发至干。收集的残余物即为C-K。
收集过程中反应产物注入到大孔吸附树脂柱(大孔吸附树脂型号为D101，天津农药厂生产)内，用水冲洗至无色，洗液与母液合并，浓缩后再次用于酶水解。
本发明用固定化酶水解人参皂苷制备C-K的方法中，所用的固定化工业酶制剂β-葡聚糖苷酶，纤维素酶，纤维二糖酶。
本发明选用pH值在5.0-7.0之间，水解温度30-45℃，水解液为水溶液。
本发明用微生物水解人参皂苷制备C-K的方法中，二醇型皂苷与固定化工业酶制剂的比例以6∶1最为经济；一般来说，水解4d后，再延长水解时间，C-K的产量增加极少，因此，无需延长水解时间。
本发明为利用人参二醇组皂苷制备C-K提供了一种来源方便、价格低廉的固定化工业酶制剂，用该方法制备C-K工艺简单方便、成本低、回收率高、无环境污染问题。使用本方法制备的C-K收率≥90％。
(四)
具体实施例方式
实施例一海藻酸钙法固定化酶转化人参二醇组皂苷制备C-K选择2种固定化工艺配方(见表1)分别加入1mL 20％的β-葡聚糖苷酶进行固定，蒸馏水作为对照组。加入到20mg/mL的三七茎叶皂苷溶液中，置于55℃水浴锅中恒温反应48h，终止反应；取出样品用水饱和正丁醇进行等体积萃取，充分震荡、静置、离心，转移至蒸发皿中挥干；重复以上萃取过程。将得到的产物用色谱甲醇定容，以HPLC检测C-K量。海藻酸钙法固定化酶的结果见表2。
两种方法中海藻酸钙法1优于海藻酸钙法2，由C-K量可知海藻酸钙法1的C-K量可达到70mg/g。从交联时间来看，第一种方法交联5小时和16h差别不太明显，而对于第二种方法，交联5h效果较好。海藻酸钠为线性高分子，Ca2+很容易与两条分子链G块作用，在两个分子链间形成洞，结合Ca2+形成“蛋盒”模型，形成热不可逆凝胶，从而将酶固定化在凝胶网络中。若交联时间过短则不能达到很好的凝胶效果，时间过长则交联程度高，高分子链结较致密，底物扩散阻力增加，酶活降低。同时，酶由胶囊内向外扩散，固定化时间过长，造成酶泄露并导致包埋率低。因此，交联时间也是固定化考虑的重要因素之一。
表1 固定化方法及胶凝剂、交联剂配方
表2 海藻酸钙法固定化酶的结果
实施例二海藻酸钙法最佳包酶浓度按照配方制备包酶量为不同体积分数的固定化酶；平行取三个浓度为20mg/mL、pH＝5.5的人参二醇组皂苷溶液，蒸馏水作为对照组；置于55℃水浴锅中恒温反应48h，终止反应；取出样品用水饱和正丁醇进行等体积萃取，充分震荡、静置、离心，转移至蒸发皿中挥干；重复以上萃取过程。将得到的产物用色谱甲醇定容，以HPLC检测C-K量。结果表明(表3)5％和10％包酶量时酶活最高，C-K产量最高，且明显高于20％和30％时的C-K量。因此确定最佳包酶浓度为10％。
表3 不同包酶浓度对固定化酶影响的结果
实施例三海藻酸钙法最佳交联时间表4为不同交联时间的反应结果，由固定化酶重复三次反应的结果可知，交联时间对固定化的结果有影响，但不太明显；交联4h后，固定化过程可基本完成，且交联4-6h后C-K量较高，所以固定化交联时间4-6h即可。
表4 不同交联时间对固定化酶影响的结果
权利要求
1.一种固定化酶制备人参抗癌有效成份的方法，包括水解、收集步骤，其特征在于用固定化酶制剂在水溶液中转化二醇型人参皂苷，二醇型人参皂苷与固定化工业酶制剂的重量比为1∶9-9∶1，pH值在5.0-7.0之间，水解温度30-45℃，水解时间2h-15d。
2.按照权利要求1所述用固定化酶，其特征在于所用的固定化酶制剂为β-葡聚糖苷酶，纤维素酶，纤维二糖酶。
3.按照权利要求1所述的一种固定化酶制备人参抗癌有效成份的方法，其特征在于所用的固定化方法为海藻酸钙法，固定化酶的制备过程按固定化配方以胶凝剂配方NaAlg∶水＝3∶100(w/w)；交联剂配方为7％的CaCl2溶液，称量样品，并在90℃左右水浴熔融，制得胶凝剂；冷却到40℃左右，然后与一定量的酶混合均匀；用注射器将海藻酸钠与酶的混合液滴入交联剂溶液中，放置于冰箱中交联4-6h；交联结束后滤出固定化颗粒，用蒸馏水洗净备用。
4.按照权利要求1所述的一种固定化酶制备人参抗癌有效成份的方法，其特征在于所述的收集过程是反应产物去除固定化酶后注入到D101大孔吸附树脂柱内，用水冲洗至无色，再用70-85％乙醇冲洗树脂柱，将洗脱液浓缩，挥发至干，收集的残余物即为人参抗癌有效成份C-K。
全文摘要
一种固定化酶制备人参抗癌有效成份的方法，包括工业酶制剂的固定化、固定化酶的转化(水解)工艺、转化产物的收集步骤。其特征在于二醇型人参皂苷分子中的糖基被固定化酶定点切除、生成目标化合物C－K[20(S)原人参二醇－20－O－β－D－吡喃葡萄糖苷，人参皂苷Compound－K简称C－K]。本发明利用固定化工业酶制剂转化人参二醇组皂苷制备C－K，解决了利用酸、碱水解人参皂苷制备C－K工艺中产生污染环境的问题。克服了现存方法中反应条件剧烈、苛刻、苷元破坏严重，产物收率低等缺陷。本发明中所用固定化工业酶制剂简单方便、成本低廉、转化效率高、可用于大批量制备C－K以满足制备抗肿瘤治疗药物的需求。
文档编号C12P1/00GK1899336SQ20061004711
公开日2007年1月24日 申请日期2006年7月4日 优先权日2006年7月4日
发明者赵余庆, 姜彬慧, 董会娟, 韩颖, 柴瑞华 申请人:辽宁中医药大学